草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

发布时间：2017-09-06 11:34

  本文关键词：草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

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【摘要】：CADMs (cell adhesion molecules)家族是一类脊椎动物特有的多功能细胞黏附因子。由于其具有介导免疫肥大细胞识别和黏附靶细胞的功能,在脊椎动物构建抵御病害感染的第一道防线中发挥重要作用。为研究CADMs在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中起作用,我们克隆了草鱼cadm2b的mRNA。用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,我们在草鱼脑组织中检测到了该基因4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5’端的序列完全相同,在3’端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、 cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6、cadm2b的cDNA序列全长1669bp,开放阅读框(ORF)1203bp,编码400个氨基酸。cadm2b X2的cDNA序列全长2783bp,开放阅读框长1323bp,编码440个氨基酸;cadm2b X3的cDNA序列全长2755bp,开放阅读框1296bp,编码431个氨基酸；cadm2b X6基因的cDNA序列全长2649bp,开放阅读框1161bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这四个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞粘附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。
【关键词】：草鱼 cadm2b 基因克隆 表达
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-31
• 1.1 CADMs家族研究进展12-25
• 1.1.1 CADMs家族的发现与各成员的表达模式12-14
• 1.1.2 CADMs家族结构特点14-18
• 1.1.2.1 CADMs家族胞外结构域14-17
• 1.1.2.2 CADMs家族胞内结构域17-18
• 1.1.3 CADMs家族的多种生理功能18-25
• 1.1.3.1 免疫相关功能18-19
• 1.1.3.2 神经系统中的作用19-21
• 1.1.3.3 CADMs在肿瘤中的相关生理作用21-24
• 1.1.3.4 CADM1与雄性不育和雌性性别发育异常24-25
• 1.2 RNA可变剪接概述25-30
• 1.2.1 RNA剪接体的组成25
• 1.2.2 剪接体的剪接机制25-27
• 1.2.2.1 剪接相关的内含子保守序列26
• 1.2.2.2 剪接体的组装与剪接过程26-27
• 1.2.3 选择性剪接的常见分类27-28
• 1.2.4 选择性剪接作用的调控因素28-30
• 1.2.4.1 剪接增强子和剪接沉默子对剪接作用的调控28-29
• 1.2.4.2 其他影响选择性剪接的因素29-30
• 1.3 本研究的目的和意义30-31
• 第二章 材料与方法31-49
• 2.1 材料31-32
• 2.1.1 实验材料31
• 2.1.2 主要试剂31
• 2.1.3 主要仪器31-32
• 2.2 方法32-49
• 2.2.1 提取草鱼组织总RNA与基因组DNA32-35
• 2.2.1.1 提取草鱼组织总RNA32-34
• 2.2.1.2 提取草鱼基因组DNA34-35
• 2.2.2 草鱼cadm2b cDNA的克隆35-45
• 2.2.2.1 草鱼脑组织第一链cDNA的合成35-36
• 2.2.2.2 克隆草鱼cadm2b cDNA引物的设计36-38
• 2.2.2.3 草鱼cadm2b全长cDNA的克隆38-42
• 2.2.2.4 PCR产物的凝胶回收42-43
• 2.2.2.5 制备和转化感受态细胞43-45
• 2.2.2.6 目的片段的连接45
• 2.2.3 草鱼cadm2b cDNA蛋白质序列预测及系统进化分析45
• 2.2.4 草鱼cadm2b在不同组织器官中的表达分析45-49
• 第三章 实验结果49-69
• 3.1 草鱼cadm2b cDNA全序列克隆与蛋白结构预测49-63
• 3.1.1 草鱼cadm2b以及cadm2b转录突变体全长cDNA的克隆49-60
• 3.1.2 草鱼cadm2b蛋白功能结构预测与聚类分析60-63
• 3.2 草鱼cadm2b在草鱼成体组织中的表达分析63-69
• 3.2.1 草鱼cadm2b在成体组织中的半定量检测63-66
• 3.2.2 草鱼cadm2b在成体草鱼组织中的实时荧光定量分析66-69
• 3.2.2.1 草鱼cadm2b实时荧光定量引物确定66-67
• 3.2.2.2 草鱼成体组织中cadm2b与cadm2bX2定量结果67-69
• 第四章 结果与讨论69-75
• 4.1 本文研究的主要结果69-70
• 4.2 草鱼cadm2b四个蛋白亚型可能的功能差异70-71
• 4.3 草鱼基因组中cadm2b前体mRNA上可能有三个选择性剪接位点71
• 4.4 草鱼cadm2b多蛋白亚型表达模式原因分析71-73
• 4.5 草鱼cadm2b基因可能在成体不同组织中介导细胞黏附73
• 4.6 存在的问题与进一步研究设想73-75
• 参考文献75-84
• 附录84

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1 梁健嘉;草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析[D];浙江大学;2016年

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本文编号：802894