高产碱性蛋白酶基因工程菌构建、表达与其粗酶微胶囊化研究

发布时间：2017-09-06 23:45

  本文关键词：高产碱性蛋白酶基因工程菌构建、表达与其粗酶微胶囊化研究

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【摘要】：本研究隶属于国家十二五技术攻关项目-《食源性功能肽生物制备技术研究》(2012BAD33B03)。以地衣芽孢杆菌2709为碱性蛋白酶基因来源,借助PCR技术、SDS-PAGE技术、Image J软件分析技术、8-395 Pro仪器微胶囊包埋技术等手段,采用单因素实验设计和响应面优化实验设计等研究方法,创新性地开展了重组菌E.coli Top 10-p GM-T-Apr的构建与鉴定,重组菌E.coli BL21-p ET-28b(+)-Apr的构建与鉴定,重组菌E.coli BL21-p ET-28b(+)-Apr的发酵优化,基于微胶囊技术固定碱性蛋白酶及酶特性研究等四个方面的研究内容,成功构建了一种单位菌密度高产碱性蛋白酶的重组菌E.coli BL21-p ET-28b(+)-Apr,确定了该重组菌以酶活性、葡萄糖利用率及菌密度为指标的发酵条件,并初步揭示了微胶囊化的粗酶有效延长了酶活半衰期,适宜条件更为温和,为后期开展碱性蛋白酶工业化生产相关研究奠定技术基础。本研究所获成果如下:(1)根据NCBI数据库设计可行引物,引入Nco I和Xho I酶切位点,经过优化PCR条件,确定最佳退火温度,扩增碱性蛋白酶目的基因Apr,其中包括开放阅读框和完整的上下游调控区。回收目的片段,连接p GM-T载体,成功构建重组菌E.coli Top 10-p GM-T-Apr,进行FD.Xho I和FD.Nco I酶切鉴定,扩增序列大小与预期一致。(2)将鉴定正确的Apr基因序列经FD.Xho I和FD.Nco I酶切纯化回收后,插入至表达载体p ET-28b(+)中,成功构建重组原核表达载体p ET-28b(+)-Apr。p ET-28b(+)-Apr转化至E.coli Top 10中,进行质粒提取并送生物公司进行测序,软件分析得出同源性高达98%。重组原核表达载体p ET-28b(+)-Apr转化至E.coli BL21中,经SDS-PAGE分析表明,目的基因Apr在E.coli BL21中表达蛋白分子量约为36 k Da。(3)以葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、盐溶液体积、培养时间和震荡速率为变量进行重组菌发酵单因素实验,综合三项指标确定显著因素和最优水平。基于单因素实验确定蛋白胨浓度、培养时间和震荡速率为变量进行响应面实验,获得重组菌发酵统计模型,综合三项指标确定最佳工艺参数为:蛋白胨浓度8.1 g/L,培养时间24 h 15 min,振荡速率180 r/min。在单位菌密度的条件下,重组菌的蛋白酶活性显著高于原始菌株;同时,葡萄糖的利用量与原始菌株并无显著差异,重组菌在工业应用中意义更大。(4)以海藻酸钠浓度,Ca Cl2浓度,固定时间,碱性蛋白酶浓度为变量,以微胶囊包埋率为指标进行粗酶微胶囊化单因素实验,确定响应面因素水平中心点。基于单因素实验确定海藻酸钠浓度,Ca Cl2浓度,固定时间,碱性蛋白酶浓度为变量进行响应面实验,获得粗酶微胶囊统计模型,确定最佳工艺参数为:在海藻酸钠浓度1.47%,无水氯化钙浓度2.93%,固定时间62 min和碱性蛋白酶浓度0.78%,在此条件下,微胶囊的包封率达到95.51%。通过对比分析游离碱性蛋白酶与微胶囊水解效果,发现游离酶与微胶囊在水解最适条件方面略有差异,在水溶液p H与温度变化中,微胶囊表现更为温和,通过微胶囊固定化大大延长了碱性蛋白酶的保存时限,在工业生产中有广泛应用前景。
【关键词】：碱性蛋白酶 基因重组 发酵优化 微胶囊
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ925
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 绪论12-17
• 1.1 碱性蛋白酶的重要应用12
• 1.2 微生物碱性蛋白酶研究进展12-14
• 1.2.1 生产菌株及构建方法研究现状12-13
• 1.2.2 菌株发酵优化研究现状13-14
• 1.3 微胶囊固定化技术研究14-15
• 1.3.1 微胶囊固定化前景概述14
• 1.3.2 微胶囊固定化方法概述14-15
• 1.4 论文研究内容15-17
• 1.4.1 研究内容15-16
• 1.4.2 研究路线16-17
• 第2章 重组菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的构建与鉴定17-26
• 2.1 材料与设备17-18
• 2.1.1 材料与试剂17
• 2.1.2 仪器与设备17-18
• 2.2 实验方法18-23
• 2.2.1 培养基、试剂配制18
• 2.2.2 目的基因Apr的扩增与回收18-21
• 2.2.3 质粒pGM-T-Apr的构建21
• 2.2.4 重组菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的构建21-22
• 2.2.5 重组菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的鉴定22-23
• 2.2.6 定量分析核酸电泳23
• 2.3 结果与分析23-25
• 2.3.1 目的基因Apr的扩增与回收研究结果23-24
• 2.3.2 重组菌E. coli Top 10-pGM-T-Apr的构建与鉴定结果24-25
• 2.4 本章小结25-26
• 第3章 重组菌E. coli BL21-pET-28b (+)-Apr的构建与鉴定26-39
• 3.1 材料与设备26-27
• 3.1.1 材料与试剂26-27
• 3.1.2 仪器与设备27
• 3.2 实验方法27-31
• 3.2.1 培养基、试剂配制27-28
• 3.2.2 目的基因Apr的获得28
• 3.2.3 质粒pET-28b (+)-Apr的构建28-30
• 3.2.4 E. coli Top 10-pET-28b (+)-Apr的构建与鉴定30
• 3.2.5 重组菌E. coli BL21-pET-28b (+)-Apr的构建与鉴定30
• 3.2.6 重组菌蛋白质表达及分析30-31
• 3.3 结果与分析31-38
• 3.3.1 目的基因Apr的扩增与回收研究结果31-32
• 3.3.2 质粒pET-28b (+)-Apr的构建研究结果32-33
• 3.3.3 E. coli Top 10-pET-28b (+)-Apr的构建与鉴定33-37
• 3.3.4 重组菌BL21-pET-28b (+)-Apr的构建与鉴定结果37
• 3.3.5 重组菌蛋白质表达及分析结果37-38
• 3.4 本章小结38-39
• 第4章 重组菌E. coli BL21-pET-28b (+)-Apr的发酵优化39-59
• 4.1 材料与设备39-40
• 4.1.1 材料与试剂39
• 4.1.2 仪器与设备39-40
• 4.2 实验方法40-43
• 4.2.1 试剂配制40
• 4.2.2 酶活测定方法40-41
• 4.2.3 葡萄糖残量测定方法建立41
• 4.2.4 菌种生长状态方法建立41
• 4.2.5 单因素试验设计41-42
• 4.2.6 响应面试验设计42-43
• 4.3 结果与分析43-58
• 4.3.1 单因素实验结果43-49
• 4.3.2 响应面实验结果49-57
• 4.3.3 重组菌与地衣芽孢杆菌发酵情况对比分析57-58
• 4.4 本章小结58-59
• 第5章 基于微胶囊技术固定碱性蛋白酶及酶特性研究59-72
• 5.1 材料与设备59
• 5.1.1 材料与试剂59
• 5.1.2 仪器与设备59
• 5.2 实验方法59-61
• 5.2.1 粗酶的纯度59-60
• 5.2.2 微胶囊包埋率方法建立60
• 5.2.3 单因素实验设计60
• 5.2.4 响应面实验设计60-61
• 5.2.5 微胶囊特性分析61
• 5.3 结果与分析61-71
• 5.3.1 粗酶纯度测定61
• 5.3.2 单因素实验结果61-64
• 5.3.3 响应面实验结果64-68
• 5.3.4 微胶囊特性分析结果68-71
• 5.4 本章小结71-72
• 第6章 结论72-74
• 6.1 全文结论72-73
• 6.2 创新点73-74
• 参考文献74-83
• 导师简介83-85
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果85-87
• 致谢87

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