辣椒素合成结构基因及MYB转录因子的克隆和功能验证

发布时间：2017-09-07 04:11

  本文关键词：辣椒素合成结构基因及MYB转录因子的克隆和功能验证

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【摘要】：辣椒素(Capsaicin)作为一类只在辣椒属植物中合成的次生代谢产物,是辣椒(Capsicum spp.)果实品质的重要部分。虽然“涮涮辣”是辣椒素含量极高的中国辣椒(Capsicum chinense Jacquin)品种,但是其坐果率低,生长周期长,抗病性差,产量低,不便用于辣椒素生产的原料品种,因此挖掘参与调控辣椒素合成的关键基因或转录因子,弄清他们的作用机制,既有利于理解辣椒素积累的分子机理,又有利于提供调控辣椒素含量的供体基因,以便于将高辣椒素基因转到经济性状优良的品种中。尽管目前对辣椒生物合成途径中的关键基因的研究已取得了重要进展,但不同辣度材料结构基因、启动子之间是否存在差异,受到哪些转录因子的调控还尚未弄清。AT3只在有辣味的辣椒中表达,辣椒素只在胎座中合成,合成途径相同辣度却存在着差异,表达的时空特异性暗示了AT3的重要性以及其合成途径受到转录因子调控的可能性。本研究通过对三种不同辣度的辣椒素合成重要结构基因的克隆及表达量进行分析,找出了重要的结构基因AMT、AT3;对“涮涮辣”AT3启动子进行活性分析,发现一些增强区域存在转录因子调控元件;并且对可能调控它的MYB转录因子进行初步验证。取得的研究结果如下:1、由于辣椒素只在胎座中合成,所以对高辣辣椒“740”(“涮涮辣”)、中辣辣椒“59”以及无辣甜椒“170”胎座的RNA进行提取,反转录成cDNA,克隆9个重要的辣椒素合成途径中的结构基因,利用生物信息学手段对其进行序列比对分析,并对果肉和胎座中的表达量进行分析,发现AMT和AT3在果肉和胎座的表达量有明显差异,AT3在甜椒中出现大片段的缺失,没有起始密码子,不能合成AT3酶,由此可知AMT和AT3在辣椒素合成过程中具有重要作用。2、选择AT3和AMT两个基因,构建VIGS表达载体,对其进行沉默,在花后16天采集辣椒胎座,进行表达量分析,胎座中的AT3和AMT表达量显著下降,花后45天采集胎座进行辣椒素含量测定,发现AMT的辣椒素含量下降了25%,AT3沉默植株的辣椒素含量几乎没有变化。3、前期研究表明,有大量MYB转录因子在胎座中显著上调表达,暗示着AT3可能受MYB转录调控,对“740”的AT3 5’端上游1889bp启动子进行分析,找出其可能的MYB结合位点,以不破坏MYB结合位点为原则,构建了5个5’端缺失表达载体,采用PEG融合进入辣椒胎座原生质体中,通过荧光显微镜进行荧光观察,找出了747bp的活性区域,再以此活性区域为模板,构建5个中间缺失表达载体,导入辣椒胎座原生质体中,通过荧光显微镜进行检测,最终确定了237bp的活性区域,该区域含有两个MYB转录因子结合位点,故而推测其受MYB转录因子的调控。4、以“740”cDNA为模板,参照辣椒基因组序列,克隆出了CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59,并进行表达量的分析,发现除CcMYB86外,CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59在胎座中的表达量都明显高于果肉。5、转录因子行使转录调控需要在细胞核中才能进行,对CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59序列分析表明其都具有保守的R2R3结构域,属于R2R3-MYB转录因子家族,且亚细胞定位结果显示其都属于核定位。6、将CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59构建到pTRV2载体中,用VIGS手段将其沉默,结果发现,在沉默植株中,CcMYB86、CcMYB2、CcMYB59在胎座中的表达量显著下调,辣椒素合成相关基因BCAT、COMT、AMT、AT3的表达量也发生了显著的变化,采用高效液相色谱法(HPLC)对辣椒素含量进行测量,发现辣椒素含量也下调了。说明这三个转录因子都参与了辣椒素的合成调控,并且BCAT、COMT、AMT、AT3都受上述3个转录因子调控。
【关键词】：“涮涮辣” 辣椒素 结构基因 启动子 转录因子
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S641.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词表(Abbreviation)7-9
• 氨基酸简写符号9-12
• 1 前言12-22
• 1.1 研究背景12-20
• 1.1.1 辣椒素的合成途径及相关基因的研究13-15
• 1.1.2 启动子简介15-17
• 1.1.3 转录因子概述17-20
• 1.2 本研究的目的和意义20-22
• 2 材料与方法22-38
• 2.1 实验材料22
• 2.2 实验方法22-38
• 2.2.1 辣椒DNA的提取22-23
• 2.2.2 辣椒胎座与果肉RNA分离与质量检测23
• 2.2.3 cDNA第一链的合成23-24
• 2.2.4 基因全长的克隆与测序24-26
• 2.2.5 PCR产物回收26
• 2.2.6 回收片段的连接26
• 2.2.7 用CaCl2法制备大肠杆菌感受态26-27
• 2.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态27
• 2.2.9 质粒DNA提取27-28
• 2.2.10 农杆菌GV3101感受态细胞的制备28-29
• 2.2.11 质粒转入农杆菌的方法29
• 2.2.12 qRT-PCR检测29-31
• 2.2.13 生物信息学分析31
• 2.2.14 启动子活性分析31-33
• 2.2.15 辣椒胎座原生质体的制备及PEG诱导的融合33-34
• 2.2.16 亚细胞定位34-35
• 2.2.17 病毒诱导基因沉默35-37
• 2.2.18 辣椒素含量测定方法37-38
• 3 结果与分析38-61
• 3.1 九个辣椒素合成相关结构基因cDNA克隆与表达量分析38-53
• 3.1.1 ACL分析38-39
• 3.1.2 BCAT分析39-40
• 3.1.3 FatA分析40-41
• 3.1.4 C4H分析41-42
• 3.1.5 COMT分析42-43
• 3.1.6 PAL分析43-44
• 3.1.7 AMT分析44-45
• 3.1.8 KAS分析45-46
• 3.1.9 AT3分析46-51
• 3.1.10 AT3和AMT基因沉默51-53
• 3.2 AT3启动子活性分析53-55
• 3.3 MYB转录因子克隆和功能验证55-61
• 3.3.1 MYB转录因子的生物信息学分析55-57
• 3.3.2 MYB转录因子在辣椒胎座和果肉中的表达量分析57
• 3.3.3 MYB转录因子亚细胞定位结果57-58
• 3.3.4 MYB转录因子的沉默58-61
• 4 讨论61-65
• 4.1 涮涮辣61
• 4.2 结构基因对辣椒素合成的影响61-62
• 4.3 启动子活性分析62-63
• 4.4 MYB转录因子与辣椒素合成结构基因间的关系63-65
• 5 结论65-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-73
• 附录A 结构基因序列比对结果73-86

【参考文献】

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本文编号：807330