虫草素合成相关酶基因克隆与表达

发布时间：2017-09-07 21:10

  本文关键词：虫草素合成相关酶基因克隆与表达

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【摘要】：虫草素具有抗炎、抗肿瘤、抑制微生物生长等明显的药理活性,现已制作出多种以虫草素为主要药性成分的成药,其临床应用前景非常广阔,但由于其在蛹虫草中含量很低,且人工合成困难,因而虫草素价格不断上扬,严重限制了其临床应用。因此研究通过生物学方法,使菌株自身虫草素表达量提高,很大程度上将解决限制虫草素应用的关键问题。本研究利用蝙蝠蛾拟青霉菌(Paecilomyces hepiali)作为实验菌种。结合转录组学和代谢组学的方法,对虫草素的代谢途径进行了探究。在已完成蝙蝠蛾拟青霉菌的全基因组测序和转录组信息初步分析的基础上,进一步分析不同转录组差异表达基因,并将差异基因进行聚类分析。筛选得到140多个目标基因,这些基因都是参与核苷酸通路代谢的上调表达基因。随后,结合STITCH化合物互作数据库,在目标基因中选定了AMI、IMP、GMP这三个基因,作为后续研究中的拟定关键酶基因。分别设计各关键酶基因的特异性扩增引物,通过PCR扩增,对关键酶基因进行克隆,随后将扩增所得片段整合至pMD18-T质粒进行测序,回收测序结果与基因序列匹配的扩增产物。接着,通过In-fusion重组技术,将目标基因分别整合到含有强启动子35S的质粒pCambia1300中。随后,利用农杆菌介导转化法将重组质粒转入蝙蝠蛾拟青霉菌中。经过多轮筛选,分别得到了AMI基因、IMP基因、GMP基因的可稳定遗传工程菌株,分别记为转基因AMI组、转基因IMP组以及转基因GMP组。利用实时荧光定量PCR技术,分别对三组工程菌中关键酶基因的表达量进行了测定。结果显示,转基因AMI组中,AMI基因表达量较阴性结果上调约2倍;转基因IMP组中,IMP基因表达较阴性对照组提高并有极显著性差异,上调达到近40倍;转基因GMP组中,GMP基因表达较阴性对照组同样明显上调并有显著性差异,上调约7倍。最后,利用液质色谱联用技术,测定转基因菌种培养液中的虫草素含量。结果表明在代谢较为旺盛的第九天,转基因AMI组和转基因IMP组的虫草素含量较阴性对照组提高了2倍,而转基因GMP组的虫草素含量较阴性对照组提高3倍之多。上述结果不但证实了选定的三个关键酶基因在虫草素代谢途径中的关键作用,也为研究虫草素代谢途径提供了理论基础,同时也为提高虫草素表达量的研究奠定了技术基础。
【关键词】：蝙蝠蛾拟青霉 虫草素 转录组学 基因克隆 转基因
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 综述11-18
• 1.1 冬虫夏草11
• 1.2 虫草素11-14
• 1.2.1 虫草素的药理作用11-12
• 1.2.2 虫草素的临床应用12
• 1.2.3 虫草素药源问题研究12-13
• 1.2.4 虫草素液体发酵生产的研究13-14
• 1.2.5 虫草素微生物发酵生产的研究14
• 1.3 蝙蝠蛾拟青霉菌（Paecilomyces hepiali）14-15
• 1.4 代谢通路关键酶研究方法概述15-16
• 1.4.1 转录组测序预测关键酶基因15-16
• 1.4.2 根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)16
• 1.5 论文主要研究目标，，内容及研究意义16-18
• 1.5.1 论文研究目标16
• 1.5.2 论文研究内容16-17
• 1.5.3 论文拟突破的难题17
• 1.5.4 论文的研究意义17-18
• 第二章 虫草素合成相关酶基因的筛选18-34
• 前言18
• 2.1 实验材料与主要试剂18
• 2.2 主要仪器18-19
• 2.3 本章技术路线19
• 2.4 实验方法19-23
• 2.4.1 蝙蝠蛾拟青霉菌培养条件19-20
• 2.4.2 样本选取20-21
• 2.4.3 转录本的重新预测与蛋白预测21-22
• 2.4.4 虫草素代谢关键酶基因的确定22-23
• 2.4.5 根据化合物关系预测虫草素合成途径23
• 2.5 结果与分析23-32
• 2.5.1 基因预测23-24
• 2.5.2 基因和蛋白序列数据比对24-27
• 2.5.3 蛋白结构域分析27-28
• 2.5.4 基因表达分析28-29
• 2.5.5 与虫草素相关的Pathway分析29-30
• 2.5.6 虫草素相关化合物的关系网络分析30-31
• 2.5.7 虫草素代谢关键酶基因分析31-32
• 2.5.8 根据化合物关系预测虫草素合成途径32
• 2.6 讨论32-34
• 第三章 关键酶基因的克隆与表达研究34-48
• 前言34
• 3.1 实验材料34-35
• 3.2 主要仪器35
• 3.3 实验方法35-43
• 3.3.1 In-fusion技术35
• 3.3.2 农杆菌介导转化法35-36
• 3.3.3 关键酶基因片段的获得36-38
• 3.3.4 重组质粒的构建38-40
• 3.3.5 重组质粒的筛选40-41
• 3.3.6 农杆菌EHA105和LBA4404转化效率的比较41
• 3.3.7 蝙蝠蛾拟青霉菌对潮霉素B的抗性浓度筛选41-42
• 3.3.8 重组质粒转入农杆菌42
• 3.3.9 农杆菌介导的蝙蝠蛾拟青霉菌的转化42-43
• 3.4 结果与分析43-46
• 3.4.1 蝙蝠蛾拟青霉菌RNA的提取43-44
• 3.4.2 关键酶基因的获得44
• 3.4.3 重组质粒的构建44-45
• 3.4.4 两种根癌农杆菌对于蝙蝠蛾拟青霉菌转化效率的比较实验45
• 3.4.5 蝙蝠蛾拟青霉菌对潮霉素B的抗性浓度筛选45-46
• 3.4.6 农杆菌介导的蝙蝠蛾拟青霉菌的转化46
• 3.5 讨论46-48
• 第四章 关键酶基因表达水平及虫草素含量的测定48-57
• 前言48
• 4.1 实验材料48
• 4.2 主要仪器48-49
• 4.3 突变菌株差异基因表达检测49-50
• 4.3.1 荧光定量PCR49
• 4.3.2 RT-PCR检测差异基因的m RNA表达49-50
• 4.4 转基因菌株中虫草素含量的测定50-52
• 4.4.1 UPLC ESI MS/MS简述50-51
• 4.4.2 虫草素含量的测定51-52
• 4.5 结果与分析52-56
• 4.5.1 突变菌株差异基因表达检测部分52-54
• 4.5.2 虫草素含量测定部分54-56
• 4.6 讨论56-57
• 第五章 论文总结57-60
• 5.1 结论57-58
• 5.2 论文的创新之处58-59
• 5.3 今后的工作展望59-60
• 参考文献60-67
• 附录 1 表目录67-68
• 附录 2 图目录68-69
• 附录 3 AMI基因序列69-70
• 附录 4 IMP基因序列70-71
• 附录 5 GMP基因序列71
• 附录 6 拟定代谢图中所涉及到的反应71-75
• 致谢75

本文编号：809907