耐辐射奇球菌反应调节基因突变体drRRA的蛋白质组学研究及其基因编辑系统的探索

发布时间：2017-09-08 06:37

  本文关键词：耐辐射奇球菌反应调节基因突变体drRRA的蛋白质组学研究及其基因编辑系统的探索

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【摘要】：耐辐射奇球菌是迄今为止地球上发现的最耐辐射的生物之一,是研究胁迫环境下细胞如何维持基因组完整性和稳定性的模式生物。耐辐射奇球菌对于电离辐射,过氧化氢和干燥等胁迫具有极强的抗性。研究表明其强大的生存能力很大程度缘自细胞对于氧化压力强大的抵抗能力,其普遍存在的双组份系统在这之中扮演了不可或缺的角色。前期研究表明DrRRA蛋白是耐辐射奇球菌双组分系统中一个重要的反应调节蛋白。转录组学分析发现该蛋白的缺失将导致包括DNA损伤响应、修复和复制相关基因表达的改变。该基因的完全敲除将导致耐辐射奇球菌细胞对于电离辐射、氧化压力等胁迫的抗性降低,表明其很有可能通过特异性的结合到下游相关基因启动子区域参与了细胞的抗氧化途径。为了进一步阐明DrRRA蛋白在细胞内的功能,我们利用蛋白质组学的方法比较了野生型耐辐射奇球菌和drRRA缺失菌株在胁迫和非胁迫环境下蛋白质的表达水平,主要结论如下：1.蛋白质组学比较分析发现野生型耐辐射奇球菌和drRRA缺失菌株在电离辐射胁迫和非胁迫环境中具有相似的蛋白质组表达变化,其中52个蛋白的表达差异在1.5倍以上,包含了31个表达下调的蛋白和21个表达上调的蛋白,表明DrRRA在蛋白质翻译水平上参与了耐辐射奇球菌细胞对于电离辐射胁迫的响应过程。2.这些表达差异蛋白可以分为以下三类：胁迫响应蛋白(7个),代谢调控蛋白(16个)以及功能未知的蛋白(20个)。3.根据蛋白质组学结果,敲除了三个具有代表性的基因：dra0259(编码过氧化氢酶E),dr1146(编码功能未知蛋白),以及dr1538(编码高渗透诱导蛋白C)。这些基因的缺失大大降低了耐辐射奇球菌对于氧化压力的抗性,验证了蛋白质组学的结果。4.由于有相当一部分的基因在数据库中并没有注释,我们尝试在耐辐射奇球菌中构建、导入一套基于CRISPR技术的基因编辑技术,进而阐明这些基因在细胞内的功能。初步实验数据表明Cas9蛋白及其所需的向导RNA能够在耐辐射奇球菌中表达。然而,这套系统并未如我们预期般的对目标基因进行敲除,还需要后续的优化。综上所述,我们比较了野生型耐辐射奇球菌和drRRA缺失菌株在不同环境下的蛋白质组表达差异,发现并验证了一系列在细胞内参与氧化损伤响应的蛋白。结合前期的转录组学分析数据,我们进一步的确认了DrRRA参与耐辐射奇球菌对于不同胁迫的响应过程。
【关键词】：耐辐射奇球菌 反应调节蛋白 蛋白质组学 基因编辑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93;Q78
【目录】：

• 致谢7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 主要缩略词12-16
• 1 引言16-40
• 1.1 耐辐射奇球菌的介绍16-29
• 1.1.1 耐辐射奇球菌的概况16-17
• 1.1.2 耐辐射奇球菌的基因组分析17-18
• 1.1.3 耐辐射奇球菌的极端抗性18-20
• 1.1.4 耐辐射奇球菌的极端抗性机制20-24
• 1.1.5 耐辐射奇球菌的DNA损伤修复机制24-28
• 1.1.6 辐射/干燥响应基序(RDRM序列)28-29
• 1.1.7 耐辐射奇球菌的生物学应用29
• 1.2 双组份信号转导系统与DrRRA的研究进展29-33
• 1.2.1 双组份信号转导系统的简介29-30
• 1.2.2 双组分系统的基本组成和作用机制30-31
• 1.2.3 反应调节蛋白的多样性及功能31-32
• 1.2.4 耐辐射奇球菌中反应调节蛋白DrRRA的研究进展32-33
• 1.3 CRISPR/Cas系统的介绍33-40
• 1.3.1 基因编辑技术简介33-34
• 1.3.2 CRISPR/Cas系统的发现34-35
• 1.3.3 CRISPR/Cas系统的免疫机制35-36
• 1.3.4 Ⅱ型CRISPR-Cas9系统36-38
• 1.3.5 CRISPR-Cas9技术的应用38-40
• 2 实验材料与方法40-57
• 2.1 菌株与质粒40-41
• 2.2 主要试剂与仪器41-43
• 2.2.1 主要试剂盒41
• 2.2.2 主要酶试剂41-42
• 2.2.3 主要仪器42-43
• 2.3 双向电泳实验方法43-46
• 2.3.1 蛋白提取43
• 2.3.2 蛋白定量43
• 2.3.3 双向电泳43-44
• 2.3.4 电泳凝胶染色44
• 2.3.5 图象扫描和分析44-45
• 2.3.6 差异蛋白质点的胶内酶解和鉴定45
• 2.3.7 数据库检索45-46
• 2.4 耐辐射奇球菌基因缺失突变株的构建及生存率的测定46-48
• 2.4.1 耐辐射奇球菌基因缺失突变株的构建46
• 2.4.2 生存率的测定46-48
• 2.5 CRISPR-Cas9质粒构建方法48-50
• 2.5.1 主要PCR引物列表48-49
• 2.5.2 主要反应体系49-50
• 2.6 主要实验方法50-57
• 2.6.1 质粒提取步骤50-51
• 2.6.2 基因组提取步骤51-52
• 2.6.3 大肠杆菌质粒转化52
• 2.6.4 点突变PCR及产物转化52-53
• 2.6.5 耐辐射奇球菌的感受态制备及质粒/PCR产物等的转化53
• 2.6.6 PCR产物纯化53-54
• 2.6.7 胶回收步骤54
• 2.6.8 RNA的提取54-56
• 2.6.9 反转录体系56
• 2.6.10 实时定量PCR反应56
• 2.6.11 生长曲线的测定56-57
• 3 实验结果分析57-76
• 3.1 耐辐射奇球菌drRRA突变株的蛋白质组学电泳图谱57-58
• 3.2 drRRA的缺失导致的蛋白质表达差异58-65
• 3.3 表达差异基因的敲除导致耐辐射奇球菌对氧化压力敏感65-67
• 3.4 耐辐射奇球菌中CRISPR-Cas9系统的构建67-71
• 3.4.1 带绿色荧光蛋白eGFP的穿梭质粒PRADG的构建67
• 3.4.2 融合绿色荧光蛋白标签的Cas9蛋白的表达质粒PRADG-Cas9的构建67-68
• 3.4.3 PRAD-Cas9的构建68-69
• 3.4.4 连有启动子的gRNA的设计69-70
• 3.4.5 PRADG-CRISPR与PRAD-CRISPR质粒的构建70-71
• 3.5 耐辐射奇球菌中CRISPRi系统的构建71
• 3.6 CRISPR-Cas9系统的在耐辐射奇球菌体内表达验证71-73
• 3.6.1 耐辐射奇球菌的质粒转化71
• 3.6.2 生长曲线的测定71-72
• 3.6.3 绿色荧光蛋白信号的检测72-73
• 3.6.4 实时定量PCR反应73
• 3.7 CRISPR系统所需进行的优化(今后的工作计划)73-76
• 3.7.1 gRNA中靶序列的改变73-74
• 3.7.2 Cas9基因前启动子的改变74-75
• 3.7.3 gRNA前启动子的改变75
• 3.7.4 转化菌株的改变75-76
• 4 讨论分析和展望76-81
• 4.1 耐辐射奇球菌drRRA突变株的蛋白质组学分析76-78
• 4.2 耐辐射奇球菌基于CRISPR技术的新型基因敲除系统的构建78-81
• 参考文献81-95
• 硕士期间发表论文95

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本文编号：812468