韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究

发布时间：2017-09-08 14:02

  本文关键词：韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究

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【摘要】：谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs,EC 2.5.1.18)是一类广泛分布于动植物、微生物等有机体内的多功能酶。GSTs主要功能是代谢生物体内的有毒物质,从而避免或降低机体受到损伤,与昆虫的抗药性相关。韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga Yang et Zhang)是韭菜等百合科蔬菜上的重要害虫,主要以幼虫聚集在韭菜地下鳞茎处进行取食危害。目前,生产上主要采用化学农药灌根进行防治,造成韭菜农药残留超标,食物中毒事件频发。由于化学农药的不合理使用导致该虫的抗药性增强,给防治工作带来困难。本研究对韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶进行克隆、表达并初步分析其功能,有助于了解韭菜迟眼蕈蚊抗性形成的分子机制,为农业生产中韭菜迟眼蕈蚊的防治提供理论依据。本研究主要结果如下:1.韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与生物信息学分析利用RT-PCR和RACE技术克隆获得两个韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶基因,即BoGSTd1和BoGSTd2。BoGSTd1开放阅读框为636bp,编码211个氨基酸,其等电点和蛋白分子量大小分别为5.94和23.72kDa。BoGSTd2开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,其等电点和蛋白分子量大小分别为5.12和23.78kDa。通过序列对比以及系统发育分析可知,两个基因均为Delta家族的GSTs基因。两者均无信号肽和跨膜区并且两个基因组DNA均不包含内含子。BoGSTd1和BoGSTd2氨基酸序列相似性为55.61%。2.韭菜迟眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2时空表达利用Real-time PCR技术测定不同发育时期和不同组织BoGSTd1和BoGSTd2的表达量。结果显示,韭菜迟眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2在其发育的各个时期均有表达,BoGSTd1在卵期表达量最高,三、四龄幼虫表达量次之,一、二龄幼虫和蛹期表达量相对较少。BoGSTd2则在卵期表达量最高,其余各个时期表达量差异不显著。BoGSTd1和BoGSTd2在不同组织中表达量存在显著差异。BoGSTd1和BoGSTd2在成虫体内的分布较为相似,在腹部表达量最高,头部和胸部次之,其他组织中表达量很少甚至不表达。3.韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶原核表达及活性测定利用原核表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化获得大小约为25kDa的可溶性体外重组蛋白BoGSTd1和BoGSTd2。用BCA蛋白定量试剂盒测定其浓度,结果显示,BoGSTd1和BoGSTd2体外重组蛋白的浓度分别为37.29 mg/ml和21.25 mg/ml。SDS-PAGE结果表明,两个纯化后的重组蛋白具有较高的纯度。以CDNB和GSH为底物,测定其活性,结果表明两个重组蛋白均能催化GSH与CDNB发生共轭反应,BoGSTd1最大反应速率Vmax为1062±60.84μmol/mg/min,米氏常数Km为0.35±0.05 mM,BoGSTd2动力学常数Vmax和Km分别为290.4±11.42μmol/mg/min和0.24±0.02 mM。GSTs在不同的pH值和温度条件下表现出的活性也存在差异,BoGSTd1和BoGSTd2都表现出随缓冲液pH值的升高活性先升高随后降低的趋势。BoGSTd1在pH约为8.0-8.5时活性最高,而BoGSTd2在缓冲液pH约为7时活性最高。体外重组蛋白BoGSTd1和BoGSTd2在40℃以下时,均表现出较高的活性。4.杀虫剂对酶活性的影响测定了三种杀虫剂对两个重组蛋白活性的影响。结果显示,浓度为0.25 mM的甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯、西维因处理后,BoGSTd1和Bo GSTd2活性均显著下降。其中甲基毒死蜱对酶活性的抑制作用最为明显,BoGSTd1和BoGSTd2残留酶活仅为11.7%和5.44%。测定了上述药剂对BoGSTd1和BoGSTd2酶活性的抑制中浓度(IC50)。结果显示,随着药剂浓度的增加,BoGSTd1酶活性逐渐降低。甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和西维因对BoGSTd1的IC50分别为0.19 mM、0.21m M和0.22 mM。随着药剂浓度的增加,BoGSTd2活性先逐渐增大然后减小直至完全被抑制。当甲基毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和西维因浓度分别达到0.25 mM、0.3125 mM和0.3125 mM时,BoGSTd2活性被完全抑制。谷胱甘肽S-转移酶抑制剂马来酸二乙酯显著地抑制了BoGSTd1和BoGSTd2活性,随着抑制剂浓度的升高蛋白活性逐渐降低,马来酸二乙酯对重组蛋白BoGSTd1和BoGSTd2的抑制中浓IC50分别为0.041 mM和0.038 mM。
【关键词】：韭菜迟眼蕈蚊 谷胱甘肽S-转移酶 原核表达 酶活测定
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.33
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1.1 韭菜迟眼蕈蚊概述11-12
• 1.1.1 韭菜迟眼蕈蚊生活习性及发生规律11
• 1.1.2 环境因子对韭菜迟眼蕈蚊的影响11-12
• 1.1.3 韭菜迟眼蕈蚊的防治12
• 1.2 谷胱甘肽S-转移酶的概述12-17
• 1.2.1 谷胱甘肽S-转移酶的分类及命名13
• 1.2.2 谷胱甘肽S-转移酶的结构13-14
• 1.2.3 谷胱甘肽S-转移酶的功能14-17
• 1.3 研究的目的和意义17-18
• 第二章 谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及表达分析18-40
• 2.1 实验材料与仪器设备18-19
• 2.1.1 供试昆虫18
• 2.1.2 实验仪器18
• 2.1.3 试剂18-19
• 2.2 实验方法19-27
• 2.2.1 总RNA的提取19
• 2.2.2 cDNA第一链的合成19-20
• 2.2.3 RACE模板的制备20-21
• 2.2.4 韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶基因克隆21-24
• 2.2.5 谷胱甘肽S-转移酶基因内含子的分析24-25
• 2.2.6 生物信息学分析25
• 2.2.7 韭菜迟眼蕈蚊BoGSTd1和BoGSTd2时空表达25-27
• 2.3 结果与分析27-38
• 2.3.1 韭菜迟眼蕈蚊总RNA的提取27
• 2.3.2 韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶保守区克隆27
• 2.3.3 韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶RACE片段克隆27
• 2.3.4 韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶基因全长cDNA的克隆27-28
• 2.3.5 序列分析28-30
• 2.3.6 韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶内含子分析30
• 2.3.7 生物信息学分析30-33
• 2.3.8 系统发育分析33-35
• 2.3.9 韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶基因表达分析35-38
• 2.4 讨论38-40
• 第三章 谷胱甘肽S-转移酶原核表达及功能分析40-53
• 3.1 材料与仪器设备40
• 3.2 实验方法40-45
• 3.2.1 GSTs开放阅读框的获得40-41
• 3.2.2 pMD-BoGSTd1、pMD-BoGSTd2和pET-28a(+)质粒的提取41
• 3.2.3 pMD-BoGSTd1、pMD-BoGSTd2和pET-28a(+)质粒双酶切41-42
• 3.2.4 原核表达载体的构建42-43
• 3.2.5 酶动力学常数的测定43-44
• 3.2.6 不同pH和温度对谷胱甘肽S-转移酶活力的影响44
• 3.2.7 杀虫剂对酶活力的影响44-45
• 3.3 结果与分析45-50
• 3.3.1 表达载体的构建45
• 3.3.2 重组蛋白的表达与纯化45-47
• 3.3.3 重组蛋白酶动力学特性47
• 3.3.4 pH和温度对谷胱甘肽S-转移酶活力的影响47-48
• 3.3.5 药剂对谷胱甘肽S-转移酶活性的影响48-50
• 3.4 讨论50-53
• 参考文献53-60
• 致谢60-61
• 个人简介61

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1 张琪;韭菜迟眼蕈蚊谷胱甘肽S-转移酶BoGSTd1和BoGSTd2基因的克隆及特性研究[D];西北农林科技大学;2016年

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本文编号：814426