SSUH2基因在牙齿发育中的分子机制研究一个掌跖角化牙周破坏综合征家系CTSC基因突变鉴定及产前诊断

发布时间：2017-09-09 01:25

  本文关键词：SSUH2基因在牙齿发育中的分子机制研究一个掌跖角化牙周破坏综合征家系CTSC基因突变鉴定及产前诊断

  更多相关文章： SSUH2 牙齿发育 牙本质发育不良 分子机制 表型分析 掌跖角化牙周破坏综合征 CTSC基因 突变分析 产前诊断

【摘要】：背景：牙齿几乎存在于所有的脊椎动物中,从胚胎早期预定成牙部位到形成完整的牙齿,是一个连续、长期并且极其复杂的生物学过程,包括上皮间充质之间相互作用、细胞分化、组织矿化、成熟和牙齿萌出。牙齿是人体中最坚硬的器官,它由牙釉质、牙本质和牙髓组成,其作为一个相对独立的整体也较容易展开发育过程的系列研究。因此,牙齿的发育过程已成为来源于上皮组织的器官发育与进化研究的最佳模型,成为了近年来研究的热点。尽管众多科学家一直致力于牙齿发育调控的研究,但截止目前为止,仍有诸多牙齿发育的机制还没被揭示,如遗传性牙本质发育不良的致病基因还没被发现,决定DSPP基因矿化特异性表达的具体机制仍不明了等。明确牙齿发育的调控机制是目前研究的热点也是难点,可以为牙齿的再生修复研究提供分子学基础,具有非常巨大的理论和临床意义。牙齿的发育是诸多信号分子之间相互作用的结果,主要包括BMMP、FGF、Hh和Wnt这四大类信号分子。BMP(Bone morphogenetic protein)是骨形成发生蛋白,除BMP-1外,其余均属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族。BMP家族中的许多成员都参与牙齿早期发育,调控牙齿的形态发生、细胞增殖和分化以及牙齿的萌发的过程,在对维持牙齿正常发育具有至关重要的作用,其中BMP2和BMP4在牙胚发育启动阶段发挥重要作用,而且对磨牙牙尖的形成起关键作用。FGF (Fibroblast growth factor)成纤维细胞生长因子是一类肽类分子,它们通过与细胞膜上特异性受体的结合来发挥作用,以此来调节细胞生长。FGF信号蛋白在牙齿发育早期就已经有表达,能通过诱导Pax9、Paxl和Pix2等转录抑制的表达来决定牙齿的形成部位。Shh属于Hedgehog (Hh)刺猬蛋白中一员,在牙板期的上皮就开始表达,并参与到牙齿的早期发育。Shh信号通路由Shh糖蛋白配体、跨膜受体Patched (Ptc)及Smoothened (Smo)、核转录因子Gli(Gli1、Gli2和Gli3)等组成。Shh信号通路在牙胚发育早期上皮-间充质和上皮-上皮之间的信号传导中发挥重要作用,特别是调控上皮和间充质细胞的增殖,诱导早期牙形态发生。Wnt是一类分泌型糖蛋白,其信号通路包括经典的Wnt-β-catenin和非经典Wnt信号通路(Wnt/JNK通路和Wnt/ca2+通路)。研究表明几乎所有器官发生过程都必需有Wnt信号通路的调控,其在牙上皮和牙间充质之间的相互诱导过程中起着重要的作用。在我们的前期研究工作中,发现了1个导致牙本质发育不良I型新的致病基因SSUH2 (C3orf32,fls184),其位于3P26.1。有文献报道称SSUH2为伴侣分子,其表达与乳糜泻有关。除此之外,针对SSUH2基因的研究仍是一片空白。本实验室研究发现,有一个牙本质发育不良的大家系中所有患者都带有SSUH2基因c.353 CA的一个杂合错义突变,经过分子学和动物模型研究,我们发现该基因的点突变会导致遗传性牙本质发育不良的表型产生,但是SSUH2参与到牙齿发育的何种信号通路以及怎样导致牙齿疾病表型产生等,仍未被揭示。所以,在本研究中我们将围绕此SSUH2基因在牙齿尤其是牙本质发育中的作用机制展开探讨。目的：揭示SSHU2基因导致牙本质发育不良疾病的分子调控机制,筛选出与SSUH2互作的蛋白,阐明该基因参与的牙齿发育相关通路。进一步完善对SSUH2基因的研究,并为牙齿尤其是牙本质和牙根的生理发育机制及相关的信号通路补充新的理论知识。材料与方法：1、研究材料：HEK293T细胞、牙龈成纤维细胞(HGF)、Ssuh2 knock out小鼠2、构建SSUH2表达载体。本研究选用pcDNA-3.1(+)-flag以及pET-41a(+)(带GST标签)来构建SSUH2过表达载体。在SSUH2的CDS区的正向引物5’端连入BamHⅠ,反向引物5’端连入Hindm,并通过这两个酶切位点将SSUH2连入pcDNA-3.1(+)-flag载体当中。pET-41A(+)-SSUH2载体构建引物的酶切位点加入顺序刚好相反,HindⅢ酶切位点加在SSUH2的CDS区正向引物5’端,BamHⅠ酶切位点则加在反向引物5’端,以此来将SSUH2连入pET-41A(+)原核表达载体当中。3、构建人SSUH2基因的过表达稳转HGF细胞株。将野生型和突变型的SSUH2基因分别构建到C端融合myc标签的慢病毒载体上,包装慢病毒,筛选出野生型和突变型SSUH2稳转HGF细胞株和空载对照HFG细胞株,并利用荧光定量PCR进行验证。4、利用免疫共沉淀(CO-IP)筛选与SSUH2有相互作用的蛋白。在HEK293T细胞中过表达flag-SSUH2融合蛋白,并利用flag标签抗体进行CO-IP实验,将IP产物进行SDS-PAGE电泳并用硝酸银染色,质谱技术鉴定差异表达的蛋白条带,并用CO-IP以及免疫印迹进行验证。5、运用RNA-seq技术在Ssuh2 knock out小鼠体内筛选出受Ssuh2表达量影响的基因。选取胚胎期15天的同一窝基因型为Ssuh-/-与Ssuh2+/+的纯合缺失及野生型小鼠,进行RNA-seq实验。6、利用荧光定量PCR验证RNA-seq结果。同样是选取胚胎期为15天的同一窝Ssuh2 knock out小鼠及野生型小鼠,通过分离牙胚组织并进行总RNA提取,并利用逆转录PCR和荧光定量PCR对RNA-seq结果进行复核。7、取30天的野生型及Ssuh2缺失型小鼠的下颌,经过固定,脱水,包埋等一系列步骤后进行石蜡切片,切片厚度为0.2微米。切片完成后,经脱蜡、复水等步骤对切片进行HE染色处理,染色完成后进行干燥封片,于倒置显微镜进行拍照。8、选取四个月大的野生型及Ssuh2缺失型小鼠臼齿固定,并进行梯度脱水,接着将样本浸泡在不同梯度的树脂中,最后将样本包埋与树脂中进行打磨。打磨好的样本先进行喷金,再通过扫描电子显微镜拍照。9、取8个月及9个月的野生型及Ssuh2缺失型小鼠进行固定,并采用显微-CT进行小鼠骨骼扫描,随后对图片进行三维重构,并计算各基因型小鼠骨密度,比较不同基因型小鼠骨骼矿化及发育的情况。10、随机选取野生型、插入移码及缺失移码Sshu2转基因小鼠若干只,接着进行小鼠悬尾实验,观察其后肢伸展状况20s,并对各小鼠进行评分,考察其腿部力量。研究结果：1、成功构建了野生型和突变型的SSUH2过表达稳转HGF细胞株,荧光定量结果显示,野生型及突变型SSHU2过表达的稳转细胞株的SSHU2 mRNA的量是对照组细胞的20倍以上(p=0.00010.05)。2、构建了pcDNA3.1 (+)-flag-SSUH2 WT/MUT真核表达载体及pET-41 A(+)-SSUH2 WT/MUT原核表达载体,所有载体均经过双酶切后电泳及测序验证,结果显示载体构建准确。3, HEK293T细胞转染pcDNA3.1(+)-flag空载及pcDNA3.1 (+)-flag-SSUH2,再用Flag抗体进行CO-IP实验,然后取IP产物进行SDS-PAGE电泳,随后进行硝酸银染色,在过表达SSUH2蛋白的SDS-PAGE胶的上样泳道的70 KDa处找出了一个差异表达蛋白条带,进一步通过质谱分析鉴定出GRP78这个基因。有报道称该基因介导了牙本质基质蛋白DPM1的入核。4、在野生型、纯合Ssuh2缺失型及纯合Ssuh2插入型小鼠的转录组中找到了29个差异表达基因。其中与牙齿、骨骼发育相关的基因有Col2a1、 CollOa1、Matn1,它们在Ssuh2 knock out小鼠中的表达均下调。并且荧光定量PCR结果显示Ssuh2 knock out小鼠Col2al、CollOal、Matnl基因mRNA表达量下降,与RNA-seq结果相符。这29个差异表达基因还包含一个转录因子Fos,其在Ssuh2 knock out小鼠中的表达是增加的。5、野生型及Ssuh2基因缺失型小鼠下颌HE染色结果显示,两组小鼠的牙齿表型并没有出现明显的差异,例如前牙本质区没有发生变化。6、野生型及Ssuh2基因缺失型小鼠臼齿经过电子扫描显微镜观察,并没有出现明显区别,两组的小鼠的牙釉质超微结构排列都比较紧密。7、选取三个时间段的野生型及Ssuh2基因缺失型小鼠进行骨骼显微-CT扫描及骨密度分析,结果显示突变型小鼠的骨骼发育没有异常,其生长矿化与野生型亦没有差别。8、对野生型、插入移码及缺失移码Sshu2转基因小鼠悬尾实验评分结果进行统计分析,结果显示三组小鼠的评分无统计学差异,说明突变型小鼠的腿部收缩力并未受到影响。结论：RNA-seq及荧光定量PCR实验结果显示SSHU2基因的表达会影响到COL2A1、COL10A1、MATN1、FOS这些基因的表达。Ssuh2 knock out、鼠的Clo2al、CollOal、Matnl基因表达下降,导致小鼠牙齿胶原蛋白的减少,使得牙本质矿化异常,从而产生牙本质发育不良表型。而且,Ssuh2 knock out小鼠的Fos基因表达增加。我们认为这是因为Fos是Ssuh2的转录因子,而且它们的表达模式还存在负反馈调控。由于小鼠体内Ssuh2表达降低,刺激Fos表达量增加,从而加强对Ssuh2基因的转录表达。CO-IP及质谱实验找出了SSHU2蛋白的相互作用蛋白GRP78(属于Hsp70热休克蛋白家族一员)。鉴于GRP78参与了牙本质基质蛋白DMP1的内吞作用,而且GRP78可以结合I型胶原蛋白COL1A1和DMP1,从而促进钙、磷沉积,参与到牙齿的矿化过程。通过分析SSUH2的氨基酸序列发现,SSUH2含有DnaJ的分子伴侣区域,DnaJ(Hsp40同源)能特异性地结合Dank(Hsp70蛋白),使其能够参与蛋白转运、折叠和错误蛋白的降解。综上所述,SSUH2是通过DanJ区域与GRP78的Dank域结合,从而影响了胶原蛋白及DMP1的转运,进而影响牙齿的矿化。野生型和突变型的SSUH2过表达的稳转HGF细胞株的构建成功,为后续的CO-IP实验及RNA-seq结果验证提供了样本。经过一系列小鼠表型实验,包括下颌HE染色、臼齿的扫描电子显微镜分析、小鼠骨骼显微-CT扫描及悬尾实验,我们并没有发现野生型和Ssuh2基因缺失型小鼠在牙齿、骨骼及腿部力量方面存在区别的情况。鉴于小鼠表型实验与我们前期研究存在不一致的情况,我们分析讨论认为是由于物种差异导致的,人类与模式生物小鼠存在很大的种间差异,其发育调控机制差别较大。小鼠的不同发育阶段,不同基因的表达存在一定的变化,某个基因对生长发育有深刻影响的特定阶段难以把握。而且生命体是非常复杂的,某个别基因的表达量改变可能会通过其他调控机制对发育进行补救调节,因此没有致病表型产生。本研究通过一系列分子实验找出GRP78、COL2A1、COL10A1、MATN1、FOS等与牙齿发育的相关基因,揭示了SSUH2基因与牙齿发育的重要基因的联系,为后续进一步研究SSUH2基因参与牙齿发育信号通路的发掘提供了重要的信息。背景掌跖角化牙周破坏综合征又名Papillon-Lefevre综合征(Papillon-Lefevre syndrome,PLS),由法国人Papillon和Lefevre于1924年首次报告。掌跖角化牙周破坏综合征(PLS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病(MIM 245000),在人群中的发病率为1～4/1000,000。该病的临床特征为牙周组织严重破坏,牙齿过早脱落,掌跖、膝盖、肘部等部位皮肤过度角化。研究显示,有部分的PLS患者还伴有硬脑膜的钙化。PLS的发病目前认为与三个因素有关,包括遗传因素、口腔微生物及环境因素。到目前为止,微生物及环境因素的致病分子机制还未被研究清楚。但是,PLS发病的遗传学基础已被证实。PLS主要由组织蛋白酶C基因(CTSC)的突变引起,突变导致组织蛋白酶C功能丧失,引起免疫调节紊乱,继而发生严重的炎症反应。CTSC基因位于常染色体11q14.1-q14.3,其编码的组织蛋白酶C(cathepsinC)亦被称作二肽肽酶(dipeptidyl peptidase I, DPP I),是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶,具有肽链内切酶活性,能从蛋白质底物的氨基酸末端去除二肽。研究表明,组织蛋白酶C能降解蛋白并活化一些酶原物质,参与体内多种免疫和炎症反应,例如吞噬细胞和T淋巴细胞的激活,用以清除病原微生物。PLS作为一种罕见的单基因遗传病在我国并不多见,所以对其的研究报道比较少,而且多是进行病例报道,并没有深入研究其发病的分子机制如CTSC基因突变筛查,明确致病基因位点和缺乏相关的产前诊断报道。所以,在我国,该基因的突变谱仍然没有得到完善,而且由于大家对此疾病并不熟知并容易忽略口腔病变而延误了早期对牙齿的防护治疗,从而导致牙齿严重缺损。研究显示近亲结婚该病的发病率明显增高,务必做好婚育知识普及和产前诊断来降低患儿出生率。目的：在本研究中,我们对来自广东惠州的一个掌跖角化牙周破坏综合征家系进行临床表型分析和通过对相关致病基因CTSC的鉴定和分离,揭示其发病的分子机制。同时,随着二胎政策的放开,为患者家庭生育二胎进行产前诊断和进一步的遗传咨询,从而在一定程度上预防患儿出生,达到提高人口素质的目的。材料与方法：1.研究对象：来自广东惠州的一个掌跖角化牙周破坏综合征家系,先证者是一个四岁的小女孩,出生两年后开始出现双侧掌跖部皮肤粗糙、脱屑,在南方医院进行口腔牙齿的治疗。2.研究方法：通过临床表型、口腔检查等对患者进行临床诊断；通过PCR扩增CTSC基因7个外显子,之后采用Sanger测序法对家系所有成员进行CTSC基因突变筛查；随后运用PolyPhen-2和SIFT软件对CTSC基因c.901GA突变进行有害性预测；同时,利用Swiss-Prot软件对CTSC蛋白野生型及突变型进行了三级结构预测；并采用荧光定量PCR技术对患者及其父母的CTSC基因mRNA进行定量分析,以及利用细胞转染及免疫印迹等技术对野生型和突变型CTSC蛋白表达量进行研究。研究结果：1、系谱及表型分析结果：通过对病人口腔及皮肤等部位的临床检查,确诊病人患有掌跖角化牙周破坏综合征(PLS),该疾病为常染色体隐性遗传病,致病基因为CTSC。2, CTSC基因突变位点确定：利用primer3.0及oligo7软件设计了7对针对CTSC外显子的引物,并对PLS家系成员基因组CTSC基因进行PCR扩增测序,测序结果通过NCBI-Blast进行比对分析。结果显示,患者(Ⅲ1) CTSC基因第7外显子存在c.901GA纯合错义突变,家系其他成员Ⅰ1,Ⅰ3,Ⅱ1及Ⅱ2均出现c.901GA的杂合突变。该碱基突变后,CTSC蛋白第301号氨基酸由甘氨酸变成丝氨酸(p.G301S)。3、mRNA水平分析：为探究CTSC基因c.901 GA纯合突变与杂合突变在体内的转录水平,本课题对家系中患者(Ⅲ1)与携带者Ⅱ1、Ⅱ2进行外周血CTSC基因mRNA定量。结果显示,该家系PLS患者患者(Ⅲ1)的CTSC基因转录水平与携带者Ⅱ1、Ⅱ2的CTSC基因mRNA表达量差异无统计学意义(P=0.480.05)。4、蛋白表达水平分析：为进一步研究突变后的CTSC蛋白的表达水平,将构建好的p-EGFP-CTSC WT和p-EGFP-CTSC MUT载体分别转染HEK293T细胞,24小时后收集蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,CTSC野生型蛋白表达量与突变型蛋白表达量差异无统计学意义(P=0.330.05)。5、生物信息学分析：CTSC基因c.901GA错义突变在PolyPhen-2软件上的预测是有害的,有害性评分是1(评分越接近1越有可能有害),且该位点高度保守。而SIFT软件上的有害性预测评分为-5.599(低于-2.5即认为该突变会影响表型),而且SIFT软件预测结果显示,无论该位点突变成何种的氨基酸,都是有害的。国外已有两个掌跖角化综合征家系CTSC基因c.901GA错义突变的报道,说明预测结果可信度极大。并且,突变的氨基酸在Swiss-Prot软件上给出的蛋白三级构型模板中是位于α螺旋附近,野生型和突变型的蛋白存在两个部分不一样,有可能因此而影响到蛋白的功能。6、产前诊断：由于该家系已有一名患者(Ⅲ1),建议患者母亲(Ⅱ 1)在二胎怀孕16-20周采集羊水进行产前诊断。该家系成员患者母亲(Ⅱ1)在怀孕18周于惠州市第一妇幼保健院产前诊断中心进行B超监测下羊膜腔穿刺,取得羊水10ml。羊水DNA采用酚/氯仿法进行提取,将得到的DNA运用设计的CTSC基因第七号外显子引物进行PCR扩增,送测序分析。结果显示,胎儿的CTSC基因同样存在纯合c.901GA错义突变,与该家系先证者基因型一致。结论：根据本课题组的研究,该惠州PLS家系患者(Ⅲ1) CTSC基因存在纯合c.901GA错义突变,该点突变有遗传病史,家系成员Ⅰ1,Ⅰ3,Ⅱ1及Ⅱ2均携带c.901GA的杂合突变。通过荧光定量PCR实验发现,患者(Ⅲ1)及其父母(Ⅱ1、Ⅱ2)外周血CTSC基因转录的mRNA量差异无统计学意义。而且,免疫印迹实验进一步证实野生型CTSC蛋白与突变型CTSC蛋白表达量差异亦无统计学意义,说明该点突变不影响CTSC基因的转录翻译。CTSC基因突变有害性预测显示该点突变有害,SIFT和PloyPhen2预测结果非常相符,同时,PloyPhen2结果显示该位点位于CTSC蛋白的高度保守区。Swiss-Port进行三维构型后结果发现,突变位点位于a螺旋附近,突变后造成突变型蛋白与野生型蛋白存在两部分不一致的区域。故此,我们的结论是该CTSC基因c.901GA突变后编码的组织蛋白酶C活性急剧下降是由于蛋白构象发生了改变,从而影响了其正常的功能。罕见病的预防最关键是孕期进行产前诊断,本研究家系成员Ⅱ1在怀孕18周到医院进行羊膜腔穿刺,通过对胎儿致病基因进行特异性扩增测序,检测出胎儿同样存在纯合的c.901GA错义突变。本课题的研究思路是先对单基因疾病进行临床诊断,通过查阅国内外对该疾病的研究,确定候选的致病基因,设计引物扩增致病基因,并进行测序分析进一步确定突变位点,再根据结果进行后续的产前诊断,这一模式有利于预防单基因罕见病患儿的出生,提高了我国出生人口的素质。本课题首次在中国人群中报道了CTSC基因c.901GA突变导致掌跖角化牙周破坏综合征,扩展了我国CTSC基因的突变谱,并且为该家系提供了定制的产前诊断服务。
【关键词】：SSUH2 牙齿发育 牙本质发育不良 分子机制 表型分析 掌跖角化牙周破坏综合征 CTSC基因 突变分析 产前诊断
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781
【目录】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-25
• 第一部分 SSUH2基因在牙齿发育中的分子机制研究25-68
• 第1章 引言25-30
• 第2章 实验材料30-34
• 第3章 实验方法34-49
• 第4章 实验结果49-60
• 第5章 分析与讨论60-63
• 参考文献63-68
• 第二部分 一个掌跖角化牙周破坏综合征家系CTSC基因突变鉴定及产前诊断68-97
• 第1章 引言68-71
• 第2章 实验材料71-75
• 第3章 实验方法75-85
• 第4章 实验结果85-92
• 第5章 分析与讨论92-94
• 参考文献94-97
• 攻读硕士学位期间所发表论文97-98
• 致谢98-100
• 英文缩略词表100-102

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