S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的构建及活性分析

发布时间：2017-09-10 01:07

  本文关键词：S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的构建及活性分析

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【摘要】：S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核细胞中具有重要的甲基循环代谢调节作用,是存在于生物细胞内调节甲基反应的一种水解酶,此水解酶广泛存在于真核细胞如:人类、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反应。研究表明人体内S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影响冠心病和阿尔茨海默症即老年痴呆病的发病概率。为了更好的研究该酶,我们通过基因克隆技术将人源表达SAHH的基因整合到毕赤酵母菌基因组上,成功构建真核表达体系,再利用毕赤酵母菌表达该目的蛋白SAHH。具体的实验方案如下:首先,我们从GenBank中查找到编码人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,在此目的基因前后设计酶切位点和重组标签His-tag。通过全基因合成技术合成拥有完整编码框的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,构建pPIC9K-sahh表达载体。然后,利用同尾酶Bgl II酶切克隆载体,通过电转化使其整合到毕赤酵母菌GS115的基因组中,用遗传霉素G418筛选出高拷贝转化子,转化子通过MD和MM平板鉴定其表型为Mut S型。经菌体PCR验证后,将筛选到的阳性转化子用1%甲醇诱导,使其分泌SAHH蛋白,之后我们利用冷冻干燥器将产物浓缩,利用0.22μm的滤膜过滤杂质和晶体。最后,我们将浓缩后的液体通过Ni-NTA亲和层析对重组SAHH蛋白进行纯化。此方法具有筛选方便、蛋白产物分泌表达稳定和易于纯化等优点。人源sahh基因包含1299个碱基对,其编码432个氨基酸,因此理论上此水解酶的相对分子量约为47.5 kDa,通过SDS-PAGE得出发酵产物的条带大小约为48 kDa。由于SAH被SAHH一步水解为高半胱氨酸和腺苷,而高半胱氨酸可直接用Ellman试剂直接定量测定,在412 nm下吸光度随着产物的升高而升高,我们测得浓缩后的SAHH蛋白酶活为626.6 IU,而经过Ni-NTA亲和层析纯化后的SAHH蛋白酶活为1106.8 IU。而对照组即sahh基因没有整合到毕赤酵母菌GS115基因组上的菌体通过此方法发酵得到的产物,测其酶活性约为1.33 IU,因此对于毕赤酵母菌GS115本身的发酵产物对本实验的研究结果可以忽略不计。同时我们通过查阅文献获知有些研究通过对表达体系的表达条件进行优化后酶活可达到1600 IU相比我们所得的酶活较高,但是我相信我们在之后的对表达体系的表达条件进行优化后一定比1600 IU高。结论:此研究中我们成功构建毕赤酵母菌真核表达体系,同时使得SAHH在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。我们的研究结果可与在病原菌中功能相似的甲基化有关的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的结构进行差异比较,筛选特异性抑制病原菌SAHN酶活性但不影响SAHH的天然化合物抑制剂。
【关键词】：S-腺苷高半胱氨酸水解酶 构建表达载体 毕赤酵母表达
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-14
• 第一章 前言14-24
• 1.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶14-24
• 1.1.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶概论14-15
• 1.1.2 S-腺苷高半胱氨酸水解酶作用底物的生成15-17
• 1.1.2.1 S-腺苷高半胱氨酸再次甲基化途径16
• 1.1.2.2 S-腺苷高半胱氨酸转硫基途径16-17
• 1.1.3 S-腺苷高半胱氨酸水解酶的结构17-18
• 1.1.4 SAHH蛋白表达系统的选择18-21
• 1.1.4.1 大肠杆菌表达系统19
• 1.1.4.2 酵母菌表达系统19-21
• 1.1.5 S-腺苷高半胱氨酸水解酶研究进展21-24
• 第二章 实验材料、仪器与方法24-40
• 2.1 实验材料24-25
• 2.2 实验仪器25-26
• 2.3 实验试剂和培养基的配制26-27
• 2.3.1 实验试剂的配制26
• 2.3.2 培养基的配制26-27
• 2.4 实验方法27-40
• 2.4.1 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因sahh的获得27-28
• 2.4.1.1 人源sahh基因的选择27-28
• 2.4.1.2 全基因合成基因序列构建载体及PCR引物设计28
• 2.4.2 目的基因的获取28-31
• 2.4.2.1 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备28
• 2.4.2.2 转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞28-29
• 2.4.2.3 阳性克隆菌体的鉴定29-30
• 2.4.2.4 双酶切反应检验质粒30
• 2.4.2.5 线性化质粒30-31
• 2.4.2.6 线性化质粒的胶回收31
• 2.4.3 毕赤酵母菌GS115表达载体的构建31-34
• 2.4.3.1 毕赤酵母菌GS115感受态细胞的制备32
• 2.4.3.2 毕赤酵母菌GS115电转化32-33
• 2.4.3.3 毕赤酵母GS115转化子的筛选与鉴定33-34
• 2.4.4 毕赤酵母GS115转化子产酶的诱导34-35
• 2.4.4.1 甲醇诱导GS115转化子表达SAHH34-35
• 2.4.4.2 SAHH蛋白液的浓缩35
• 2.4.5 亲和层析35-38
• 2.4.5.1 SAHH蛋白亲和层析35-36
• 2.4.5.2 SAHH蛋白洗脱液除盐36
• 2.4.5.3 SDS-PAGE定量分析SAHH蛋白36-38
• 2.4.6 SAHH蛋白活性测定38-40
• 2.4.6.1 SAHH蛋白活性测定的原理38
• 2.4.6.2 制作标准曲线38
• 2.4.6.3 SAHH蛋白活性测定方法38-40
• 第三章 实验结果与分析40-52
• 3.1 PPIC9K、PPIC9K-SAHH质粒的提取40-41
• 3.2 PPIC9K-SAHH双酶切反应验证41-42
• 3.3 PPIC9K-SAHH和PPIC9K质粒线性化42-43
• 3.4 线性化质粒PPIC9K-SAHH和PPIC9K的胶回收43-44
• 3.5 转化子筛选与验证44-47
• 3.5.1 高拷贝转化子的筛选44-46
• 3.5.2 PCR产物测序46-47
• 3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果47-49
• 3.7 SAHH蛋白活性测定49-52
• 3.7.1 半胱氨酸标准曲线的绘制49-50
• 3.7.2 SAHH蛋白活性测定50-52
• 第四章 结论与展望52-54
• 参考文献54-60
• 致谢60-62
• 附录62

【参考文献】

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本文编号：823825