烟草根系钾通道基因NTORK1的功能及调控研究

发布时间：2017-09-10 23:24

  本文关键词：烟草根系钾通道基因NTORK1的功能及调控研究

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【摘要】：为研究烟草钾通道基因NTORK1是否受激素调控,参与调节根系的钾外流,利用p BI121和p ER8(含XVE系统)为骨架载体,分别构建了NTORK1启动子驱动GUS的表达载体和受ES诱导启动NTORK1的RNAi表达载体。通过农杆菌介导瞬时转化和稳定遗传转化,分别研究了NTORK1启动子和NTORK1基因的功能。获得的结果如下:1、使用不同浓度SA和NAA处理低钾Hoagland培养液培养的烟草K326植株,然后检测植株根外钾离子含量变化,同时使用Real-time PCR分析NTORK1基因的表达量。结果显示,50μmol/L SA能抑制根钾离子外流;500μmol/L SA能诱导根钾离子外流,并诱导NTORK1基因的表达。2、构建了NTORK-GUS表达载体。以p BI121载体为基础,克隆NTORK1基因上游2111bp片段替换原载体上的35S启动子。构建了NTORK1启动子驱动的GUS基因表达载体p BI121-NTORK。3、通过烟叶瞬时转化p BI121-NTORK表达载体和不同激素处理。结果显示,NTORK启动子受5.4μmol/L NAA和500μmol/L SA的诱导表达。4、构建了NTORK1的RNAi表达载体。以p ER8载体为基础,在多克隆位点插入NTORK1基因的RNAi片段、Tnos终止子、DR5启动子和GUS。其中RNAi片段来自NTORK1基因3’端250bp片段和actin内含子。5、通过叶盘稳定转化NTORK1的RNAi表达载体,获得大量潮霉素抗性苗。经PCR鉴定获得多株转基因阳性苗。使用5μmol/L 17-β-雌二醇(Es)诱导转基因植株,Real-time PCR结果表明转基因烟草NTORK1的表达被抑制,抑制率最高达到90%。6、使用含5μmol/L 17-β-雌二醇的低钾Hoagland培养液对转基因和非转基因烟草水培3d。然后在分别含5μmol/L Es、5μmol/L Es+50μmol/L SA、5μmol/L Es+500μmol/L SA的无钾Hoagland培养液中各处理40min。通过检测培养液的钾离子浓度,以及叶片NTORK1基因的表达量。结果显示,在Es+500μmol/L SA培养液中,转基因与非转基因植株的NTORK1表达量比在Es+50μmol/L SA处理中增加,同时转基因植株的培养液钾离子含量明显低于非转基因植株。以上说明,NTORK1受SA调控,介导烟草根系的钾离子外流,500μmol/L的SA能诱导NTORK1表达并增加培养液的钾离子含量,而50μmol/L SA的效果相反。最终,获得的研究结论如下:1.高浓度SA和低浓度NAA能诱导NTORK1表达;2.高浓度SA能诱导根钾外流,低浓度SA抑制根钾外流;3.NTORK1介导钾离子外流,并且受SA调控。本研究首次将植物激素、NTORK1和根钾外流联系在一起,为改善烟草钾含量提供了理论依据。
【关键词】：烟草 钾通道 NTORK1 植物激素 转基因 RNAi
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S572;Q943.2
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 植物钾离子的吸收转运与调节11-15
• 1.1.1 低亲和性钾离子吸收系统11-13
• 1.1.2 高亲和性钾离子吸收系统13-15
• 1.2 钾离子外流15-21
• 1.2.1 根钾离子外流是响应胁迫的正常反应15-18
• 1.2.2 钾离子外流通道18-20
• 1.2.3 组成型钾离子通道的功能20-21
• 1.3 烟草钾离子外流通道NTORK1与植物激素21-22
• 1.4 研究目的和意义22-23
• 第二章 激素对NTORK1启动子的诱导分析23-42
• 2.1 实验材料及试剂23
• 2.1.1 实验材料23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.2 主要实验仪器23-24
• 2.3 主要溶液的配置24-27
• 2.3.1 主要培养基的配置24-26
• 2.3.2 试剂的配置26-27
• 2.3.3 引物序列27
• 2.4 实验方法27-33
• 2.4.1 NAA和SA处理烟草测植物根钾离子外流27-28
• 2.4.2 qPCR检测激素处理烟草根基因表达28-29
• 2.4.3 NTORK1的启动子克隆及激素诱导分析29-33
• 2.5 结果与分析33-42
• 2.5.1 SA和NAA处理非转基因K326烟草33-36
• 2.5.2 NTORK1的启动子克隆及激素诱导分析36-42
• 第三章 NTORK1基因RNAi表达载体42-65
• 3.1 实验材料及试剂42
• 3.1.1 实验材料`42
• 3.1.2 主要试剂42
• 3.2 主要实验仪器42
• 3.3 主要溶液的配置42-46
• 3.3.1 主要培养基的配置42-45
• 3.3.2 试剂的配置45
• 3.3.3 引物序列45-46
• 3.4 实验方法46-56
• 3.4.1 pER8-A-GUS表达载体的构建46-49
• 3.4.2 遗传转化烟草K32649-54
• 3.4.3 NTORK1基因功能验证54-56
• 3.5 结果与分析56-65
• 3.5.1 pER8-A-GUS表达载体构建56-60
• 3.5.2 遗传转化烟草K32660-63
• 3.5.3 NTORK1基因功能验证63-65
• 第四章 讨论65-67
• 4.1 水杨酸对NTORK1基因的影响65
• 4.2 生长素对NTORK1基因的影响65
• 4.3 水杨酸、NTORK1与钾外流关联65-67
• 第五章 总结与展望67-68
• 5.1 结论67
• 5.2 展望67-68
• 致谢68-70
• 参考文献70-79
• 附录79-80

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本文编号：827267