烟草orf25、atp9基因的RNAi载体构建及遗传转化

发布时间：2017-09-11 11:19

  本文关键词：烟草orf25、atp9基因的RNAi载体构建及遗传转化

  更多相关文章： 烟草 orf25基因 atp9基因 RNAi 遗传转化

【摘要】：杂种优势的利用可以有效地使烟草实现高产、高抗、优质的育种目标。目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。本文以烟草雄性不育相关基因orf25和atp9为对象,通过RNA干扰技术,分别构建了烟草orf25、atp9基因的RNAi表达载体pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi,并通过农杆菌介导烟草遗传转化技术获得转基因烟草苗,以探讨烟草雄性不育相关基因orf25、atp9的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用,为选育烟草雄性不育系植株奠定基础。主要研究结果如下:1、烟草orf25、atp9基因干扰片段的获得:依据实验室保存的orf25、atp9基因全长cDNA序列,分别设计特异性引物,扩增orf25、atp9基因的正、反义干扰片段:orf25基因扩增片段为606bp,atp9基因扩增片段为239bp。2、烟草orf25、atp9基因的RNAi表达载体的构建:根据RNAi表达载体构建原则,将长度为606bp的orf25基因的正、反向干扰片段插入到大小为190bp的linker片段的两侧,长度为239bp的atp9基因的正、反向干扰片段插入到linker片段的两侧,分别构成含linker间隔片段稳定发夹结构的RNA干扰片段。以pET30a和pCAMBIA1301为桥梁载体,成功的构建orf25、atp9基因的RNA干扰表达载体pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi。3、烟草遗传转化条件的建立:农杆菌GV3101侵染烟草叶片最适宜的侵染浓度OD600值为0.5;最适宜的侵染时间为8分钟;烟草预培养最佳时间为3天;侵染后28℃暗培养最佳时间为3天;抗性筛选物卡那霉素最佳浓度为80 mg/L;农杆菌抑制剂头孢霉素的最佳浓度为400 mg/L。4、烟草转基因苗的获得:利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi分别转入烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%;获得41株转pCAMBIA1301-atp9-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有20株,转化率为48.8%。
【关键词】：烟草 orf25基因 atp9基因 RNAi 遗传转化
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S572;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 第一章 文献综述8-20
• 1 植物雄性不育性研究8-10
• 1.1 细胞核雄性不育(GMS)相关基因研究8-9
• 1.2 细胞质雄性不育(CMS)相关基因研究9
• 1.3 orf25基因研究现状9-10
• 1.4 atp9基因研究现状10
• 2 RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究10-14
• 2.1 RNA干扰的作用机制11
• 2.2 RNA干扰的特点11-12
• 2.3 RNA干扰技术在烟草中的应用12-14
• 2.3.1 RNA干扰技术在烟草基因功能研究中的应用12
• 2.3.2 RNA干扰技术在烟草抗病研究中的应用12-13
• 2.3.3 RNA干扰技术在烟草虫害防治研究中的应用13-14
• 2.3.4 RNA干扰技术在烟草品质改良研究中的应用14
• 3 烟草遗传转化技术14-18
• 3.1 植物基因工程的现状14-15
• 3.2 植物基因工程的前景15
• 3.3 农杆菌介导烟草遗传转化法15-17
• 3.4 DNA直接导入烟草法17
• 3.5 基因枪法17
• 3.6 电击法17
• 3.7 花粉管通道法17-18
• 4 本研究的目的和意义18
• 5 研究内容和技术路线18-20
• 第二章 材料与方法20-31
• 1 实验材料20-22
• 1.1 植物材料20
• 1.2 菌株和质粒20
• 1.3 主要仪器设备20
• 1.4 主要实验试剂20
• 1.5 培养基以及抗生素的配置20-22
• 2 实验方法22-31
• 2.1 烟草orf25、atp9基因RNAi载体构建22-27
• 2.1.1 引物设计22
• 2.1.2 目的基因干扰片段的扩增及回收22-23
• 2.1.3 连接T载体23-24
• 2.1.4 构建pET30a-orf25(+)、pET30a-atp9(+)24-25
• 2.1.5 构建pET30a-orf25(+)-linker、pET30a-atp9(+)-linker25-26
• 2.1.6 构建pET30a-orf25(+)-linker-orf25(-)26
• 2.1.7 构建pET30a-atp9(+)-linker-atp9(-)26
• 2.1.8 构建pCAMBIA1301-orf25-RNAi、pCAMBIA1301-atp9-RNAi26-27
• 2.2 RNAi表达载体转化农杆菌27-28
• 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备27
• 2.2.2 质粒DNA直接导入农杆菌27-28
• 2.2.3 农杆菌转化子的鉴定28
• 2.3 农杆菌介导烟草遗传转化体系的构建及优化28-30
• 2.3.1 叶盘法转化烟草28-29
• 2.3.2 外植体预培养时间的确定29
• 2.3.3 卡那霉素浓度的筛选29
• 2.3.4 菌液浓度及侵染时间的确定29
• 2.3.5 共培养时间的确定29
• 2.3.6 头孢霉素浓度的筛选29
• 2.3.7 转基因烟草植株的获得29-30
• 2.4 转基因烟草植株的检测30-31
• 第三章 结果与分析31-44
• 1 orf25、atp9基因RNAi载体构建31-36
• 1.1 基因片段的PCR扩增31
• 1.2 pET30a-orf25(+)、pET30a-atp9(+)的构建及鉴定31-32
• 1.3 pET30a-orf25(+)-linker、pET30a-atp9(+)-linker的构建及鉴定32-33
• 1.4 pET30a-orf25(+)-linker-orf25(-)的构建及鉴定33-34
• 1.5 pET30a-atp9(+)-linker-atp9(-)的构建及鉴定34
• 1.6 pCAMBIA1301-orf25-RNAi的构建及鉴定34-35
• 1.7 pCAMBIA1301-atp9-RNAi的构建及鉴定35-36
• 2 RNAi表达载体转化农杆菌的鉴定36-37
• 3 烟草遗传转化体系的优化37-40
• 3.1 外植体预培养时间的确定37
• 3.2 卡那霉素浓度的筛选37-38
• 3.3 菌液浓度及侵染时间的确定38-39
• 3.4 共培养时间的确定39-40
• 3.5 头孢霉素浓度的筛选40
• 4 转基因烟草植株的获得40-41
• 5 转基因烟草PCR检测41-44
• 结论44-45
• 讨论45-48
• 1 RNA干扰载体的构建45
• 2 根癌农杆菌介导烟草遗传转化45-46
• 2.1 卡那霉素筛选浓度的确定45-46
• 2.2 烟草叶片的选择46
• 2.3 农杆菌的抑制46
• 3 下一步的研究设想46-48
• 参考文献48-56
• 致谢56

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘文博;张小荣;曹永忠;吴艳涛;焦新安;刘秀梵;;非抗性RNAi载体及沙门氏菌递送系统的构建[J];扬州大学学报;2006年01期

2 赵峰玉;郑银英;张瑜;乔亚红;崔百明;向本春;;抗番茄花叶病毒RNAi载体的构建及烟草遗传转化[J];石河子大学学报(自然科学版);2011年02期

3 马立安;张忠明;;拟南芥Ran2基因超表达和RNAi载体的构建[J];长江大学学报(自科版)农学卷;2007年02期

4 荣光;王新华;薄新文;连宏军;钟发刚;邓宇;陈琛;夏伦斌;郭燕;王运宏;;捻转血矛线虫Hc38基因的克隆及其RNAi载体的构建[J];动物医学进展;2007年01期

5 张莹莹;李朝;杨志新;许龙;朱恒奇;周晓巍;黄培堂;;应用H1-U6双启动子RNAi载体筛选人泛素结合酶hUBE2W的RNAi有效靶点[J];生物工程学报;2008年11期

6 郑寒;陈烨;陈静;马建华;刘燕;付体华;;HvABA8′OH-1基因RNAi载体的构建及遗传转化[J];应用与环境生物学报;2010年01期

7 张凌云;邓赞;安静;;柑橘CsPRP4基因RNAi载体的构建[J];贵州师范大学学报(自然科学版);2013年01期

8 朱炜;魏建民;乌日罕;;拟南芥Ca~(2+)泵基因ACA_2的RNAi载体的构建及转基因植株的筛选[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2008年04期

9 李晓明;高朝宝;彭明;崔百明;;棉蚜Catb5基因RNAi载体的构建及其对烟草的转化[J];生物技术通报;2010年08期

10 彭琦;张源;双桑;魏然;伍林涛;丁昕;阮颖;刘春林;;甘蓝型油菜Fad2与Fae1基因双干扰RNAi载体的构建[J];生物技术通报;2007年05期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 孙朕;樊宝良;;有效避免干扰素反应的RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动表达长dsRNA的RNAi载体的设计、构建及初步验证[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

2 王静;龚萍;马骁;龚炎长;彭秀丽;俸艳萍;李世军;;逆转录病毒介导的鸡Foxl2基因RNAi载体的构建[A];安全优质的家禽生产——第十五次全国家禽学术讨论会论文集[C];2011年

3 邱枫;高洪文;许雷;;基于柠条pal基因的RNAi载体构建、农杆菌转化及转基因植株检测的研究[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第八次学术研讨会论文集[C];2008年

4 斯钦巴特尔;张辉;哈斯阿古拉;贾霄云;李强;高凤云;;亚麻雄性不育相关基因的克隆及RNAi载体构建[A];东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会论文汇编[C];2009年

5 于丹;金春顺;杨景朴;刘岩;文连姬;赵胤;;新型RNAi载体的构建及其对喉癌干细胞增殖抑制及诱导凋亡的研究[A];吉林省医学会第九次耳鼻咽喉—头颈外科学术会议论文汇编[C];2011年

6 林杉;田占伟;古丽汗·阿不都热木;陈宝麒;张文祥;赵宗胜;;绵羊颗粒细胞抑制素βA基因RNAi载体的构建[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王元英;烟草抗病基因筛选及其高通量RNAi载体库的构建[D];中国农业科学院;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 贾启涛;水牛抑制素α亚基基因（INHA）RNAi载体干扰效果分析及其转基因小鼠模型的构建[D];华中农业大学;2013年

2 耿文超;棉叶螨TtAK与TtCHI双价RNAi载体的构建及抗虫性初步研究[D];石河子大学;2016年

3 康骏璞;交换形成相关基因的RNAi载体构建及转化甘蓝型油菜研究[D];华中农业大学;2016年

4 谢丽娟;烟草orf25、atp9基因的RNAi载体构建及遗传转化[D];江西农业大学;2016年

5 樊绍刚;黑麦草重结晶抑制蛋白基因家族的克隆及其RNAi载体的构建[D];中南林业科技大学;2010年

6 郭文静;水稻osvdac基因RNAi载体的构建及其在转基因植株中的表达分析[D];中南民族大学;2013年

7 刘媛;以sbe A和B为靶标的RNAi载体构建及对马铃薯的转化[D];甘肃农业大学;2007年

8 王欣茹;褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆及其RNAi载体的构建和转化[D];华中农业大学;2012年

9 黄志鹏;红麻CMS系和保持系能量代谢相关基因的克隆、表达及RNAi载体构建[D];广西大学;2014年

10 石晓;抑制菊花DgLsL基因表达的RNAi载体构建及其遗传转化[D];中国农业科学院;2012年

，

本文编号：830425