表达1型和3型鸭甲肝病毒VP1基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

发布时间：2017-09-12 03:18

  本文关键词：表达1型和3型鸭甲肝病毒VP1基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

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【摘要】：鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是一种高度致死性传染病,由鸭甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)引起,其特点为发病急、传播快、病程短、病死率高,主要侵害三周龄以内的雏鸭,给养鸭业造成严重损失。当前DHAV-1和DHAV-3是国内流行的主要血清型,中国内地尚未见分离到DHAV-2的报道。目前鸭病毒性肝炎卵黄抗体和鸭甲型肝炎活疫苗是防治鸭肝炎的主要措施,常规疫苗在防制方面存在一定的不足,因此需要研制更安全、有效的新型疫苗。新城疫(Newcastle Disease,ND)是危害养禽业的重要传染病之一,近年来,新城疫对鸭的危害日趋严重。控制新城疫的主要措施是疫苗接种和严格的生物安全措施,随着反向遗传操作技术的深入发展,新城疫病毒活载体疫苗得到广泛的研究和应用。为了研发一种安全有效的双价苗,本研究以NDV LaSota弱毒疫苗株为载体,构建共表达DHAV 1型和3型VP1基因的重组NDV活疫苗,用于1型、3型鸭病毒性肝炎和鸭新城疫的预防,不仅可以弥补当前DHAV-3疫苗的空白,还可达到一针防多病的效果。本研究主要主要包括以下四部分内容:1.表达鸭肝炎1型和3型VP1基因重组新城疫病毒载体的构建利用Trizol试剂提取DHAV-1和DHAV-3病毒RNA,分别扩增得到DHAV 1VP1-2A和DHAV 3VP1基因。利用SOE PCR方法进行1型和3型鸭甲肝病毒VP1基因的连接,扩增产物DHAV 1VP-2A-3VP1经1%琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段约为2368bp,与预期相符。以含有LaSota全长cDNA的重组质粒p LS-RFP(P基因和F基因间插有RFP报告基因)为载体,利用In-Fusion?PCR Cloning Kit将目的基因DHAV 1VP1-2A-3VP1插入到新城疫基因组P基因和F基因间,构建含有1型、3型鸭甲肝病毒VP1基因重组质粒p LS-1VP1-2A-3VP1,进一步PCR检测和序列测定证实DHAV 1VP-2A-3VP1基因正确插入到p LS载体中。2.重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救为了从克隆的cDNA中拯救感染性NDV,将重组质粒pLS-1VP1-2A-3VP1与表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染HEp-2细胞。收获转染细胞上清接种于10日龄SPF鸡胚,在鸡胚中连续传代。将拯救病毒命名为rLS-1VP1-2A-3VP1,并通过HA、RT-PCR、IFA等试验进行鉴定。鉴定结果表明,重组病毒r LS-1VP1-2A-3VP1被成功拯救。3.重组病毒的生物学特性测定通过重组病毒株r LS-1VP1-2A-3VP1对鸡胚的半数感染量(EID50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、1日龄SPF鸡脑内致病指数(ICPI)、6周龄SPF鸡静脉内致病指数(IVPI)和生长曲线的测定,结果表明重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1成功拯救出并保持了原重组疫苗株rLS-RFP对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。4.种鸭免疫试验本研究选用种鸭进行免疫试验,通过种鸭的多次免疫保证雏鸭有较高的母源抗体,能安全渡过危险期。雏鸭免疫效果有待进一步证实。将E5代重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1(病毒毒价107.2EID50/0.1mL)经点眼滴鼻免疫4月龄种鸭,每羽1mL,初次免疫10天后采血,采用固定病毒-稀释血清法做血清中和试验,重组病毒免疫种鸭血清中DHAV-1和DHAV-3抗体平均效价分别为1:18.17和1:16.60,表明该重组毒可诱导种鸭产生相应的中和抗体。利用Western blot进一步验证重组病毒r LS-1VP1-2A-3VP1免疫种鸭血清能和DHAV-1和DHAV-3 VP1表达蛋白发生较强的反应。以上结果表明重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1具有作为用于种鸭免疫的鸭肝炎重组病毒活载体疫苗的潜力。
【关键词】：新城疫 鸭肝炎 反向遗传操作 活载体疫苗
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 引言12-22
• 1.1 新城疫反向遗传操作研究进展12-19
• 1.1.1 新城疫病毒形态结构及分子生物学特征12-13
• 1.1.2 NDV的安全性评价13
• 1.1.3 NDV的反向遗传学技术13-14
• 1.1.4 新城疫的反向遗传系统的组成14-16
• 1.1.5 NDV作为疫苗载体的研究进展16-19
• 1.2 鸭病毒性肝炎疫苗研究进展19-21
• 1.2.1 灭活疫苗19
• 1.2.2 弱毒疫苗19-20
• 1.2.3 基因工程疫苗20-21
• 1.3 本研究的目的和意义21-22
• 2 材料与方法22-47
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 病毒株、细胞及实验动物22
• 2.1.2 主要仪器22
• 2.1.3 主要试剂22-23
• 2.1.4 主要试剂的配制23-24
• 2.2 方法24-47
• 2.2.1 1型、3型DHAV VP1基因的连接24-30
• 2.2.2 表达DHAV 1VP1-2A-3VP1重组新城疫病毒的构建30-37
• 2.2.3 重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救37-40
• 2.2.4 HA和HI的测定40
• 2.2.5 重组病毒的RT-PCR鉴定40-41
• 2.2.6 重组病毒的电镜观察41-42
• 2.2.7 间接免疫荧光试验（IFA）42
• 2.2.8 重组病毒滴定、致病性及生长动力学检测42-44
• 2.2.9 种鸭免疫试验44-45
• 2.2.10 Western blot45-47
• 3 结果和分析47-55
• 3.1 1型、3型DHAV VP1基因的连接47-48
• 3.1.1 SOE-PCR连接DHAV-1VP1-2A和DHAV-3VP147
• 3.1.2 质粒pT-1VP1-2A-3VP1的提取和酶切鉴定47-48
• 3.2 表达DHAV-1VP1-2A-3VP1重组新城疫病毒的构建48-50
• 3.2.1 PCR线性化新城疫病毒载体48-49
• 3.2.2 线性化新城疫载体的病毒纯化49
• 3.2.3 In-Fusion连接反应49
• 3.2.4 重组质粒p LS-1VP1-2A-3VP1的鉴定49-50
• 3.3 重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救50-51
• 3.4 重组病毒的RT-PCR鉴定51
• 3.5 病毒滴定、致病性及生长动力学检测51-52
• 3.6 电镜观察52-53
• 3.7 IFA鉴定53
• 3.8 重组病毒免疫种鸭血清中DHAV-1 和DHAV-3 抗体的检测53-54
• 3.9 Western blot鉴定54-55
• 4 讨论55-57
• 4.1 重组新城疫病毒的拯救55-56
• 4.2 种鸭免疫试验56
• 4.3 重组NDV构建的改善56-57
• 5 结论57-58
• 6 参考文献58-63
• 7 致谢63

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