LPS对卵泡颗粒层和膜层细胞Toll受体基因表达和类固醇激素合成的影响

发布时间：2017-09-12 04:23

  本文关键词：LPS对卵泡颗粒层和膜层细胞Toll受体基因表达和类固醇激素合成的影响

  更多相关文章： 鹅 等级卵泡 Toll样受体 内毒素 性类固醇激素合成

【摘要】：为研究种鹅等级卵泡的病原识别模式受体和内分泌功能对细菌内毒素(LPS)的反应性,探讨Toll样受体(TLRs)在种鹅生殖免疫中的作用及其与生殖内分泌的关系,以加深对生殖系统感染和生殖调控的理解,寻找有效的治疗方法和免疫新靶位,我们以产蛋期扬州鹅为实验动物,在种鹅产蛋后8h和2h以及产蛋前4h、16h和28h翅静脉注射LPS(1.5 mg/kg BW),在其产蛋8h后翅静脉采集血液,并屠宰采集卵巢卵泡,观察卵泡外观形态,分离等级卵泡的膜层和颗粒层。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和放射免疫分析法等技术分别研究种鹅产蛋期卵泡颗粒层(GL)和膜层(TL)的TLRs表达谱及表达差异;TLRs在不同生长期卵泡GL和TL的表达差异;LPS处理0h,6h,12h,24h和36h后卵泡外观形态的变化及GL和TL TLRs的表达变化,以及血液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的浓度及其合成限速酶基因类固醇激素合成急性调节蛋白(St AR),胆固醇侧链裂解酶基因(CYP11A1),17ɑ-羟化酶和17,20裂解酶基因(CYP17A1),细胞色素P450芳香化酶基因(CYP19A1)的表达变化。结果显示,颗粒细胞中,除了TLR2-2几乎不表达,其余所有的TLRs成员,包括TLR1-1,TLR1-2,TLR2-1,TLR3,TLR4,TLR5,TLR7,TLR15和TLR21都表达;膜细胞则表达所有禽类TLRs成员。产蛋期种鹅,4个TLRs家族基因在GL中的表达水平极显著高于TL(P0.01),3个TLRs成员在TL的表达量极显著高于GL(P0.01)。随着卵泡的生长发育,各个TLRs的表达水平相对较稳定,仅TLR15在GL中的表达水平随卵泡发育而增强(P0.05),TLR2-1和TLR15在TL中的表达水平随卵泡发育显著增强(P0.05)。LPS处理12小时内,等级卵泡外观形态无明显变化,24h时,部分鹅卵泡出现不规则的胶冻状变性,而36h时,所有实验鹅卵泡皆出现胶冻状变性。GL中8个TLRs家族基因的表达水平随LPS作用时间增加而显著增强(P0.01),而TLR3的表达水平呈现减弱的趋势,这些TLRs出现差异显著的时间点不同。与在GL不同的是,TL中,10个TLRs家族基因在LPS作用后其表达水平都逐步增强,并于不同时间点达到差异极显著(P0.01)。LPS处理后,鹅血液中P4和E2的浓度显著降低(P0.01),都于12h时达到差异显著,而其合成限速酶基因St AR和CYP11A1,CYP17A1和CYP19A1的表达也减弱,分别于6h,6h,12h和6h时发生显著改变(P0.01),其中St AR的表达水平呈现先增强后减弱的趋势。综合上述试验结果表明,种鹅卵泡中表达各个TLRs家族基因,存在TLRs介导的先天性免疫反应。颗粒细胞和膜细胞对不同病原微生物的敏感性不同,其潜在的抵御病原微生物的能力也不同。随着种鹅卵泡的生长发育,颗粒细胞和膜细胞的病原识别能力增强。LPS直接危害卵泡发育及排卵,所有禽类TLRs家族基因的表达水平都随之发生显著变化,并可分为早期,中期和后期应答基因,早期卵泡损伤小,是治疗LPS入侵的最佳时期。此外,LPS还降低P4和E2的合成及其关键限速酶基因的表达,危害鹅的生殖内分泌。基于研究结果,我们推测LPS入侵后,卵泡通过TLRs介导性类固醇激素的合成,且这一过程可能存在时间依赖性。本研究对水禽业养殖环境的控制及开发内毒素抑制剂、新型减毒疫苗和佐剂可提供参考,对水禽生殖免疫和生殖内分泌,及两者之间关系进行了初步探讨,为其深入研究奠定基础。
【关键词】：鹅 等级卵泡 Toll样受体 内毒素 性类固醇激素合成
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S835
【目录】：

• 符号说明5-9
• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-28
• 1.1 TLRs的概述14-21
• 1.1.1 TLRs的结构14-15
• 1.1.2 TLRs的配体15
• 1.1.3 TLRs的分布15-16
• 1.1.4 TLRs信号转导途径16-18
• 1.1.5 TLRs在免疫系统中的作用18
• 1.1.6 TLRs与生殖免疫调节18-21
• 1.2 LPS的概述21-25
• 1.2.1 LPS的结构21-22
• 1.2.2 LPS的受体22-23
• 1.2.3 LPS的信号通路23-24
• 1.2.4 水禽养殖环境LPS的来源24-25
• 1.2.5 LPS对种鹅的危害25
• 1.3 P4、E2与其合成关键限速酶基因的概述25-27
• 1.4 TLRs与P4、E2的关系27-28
• 1.5 本研究的目的意义28
• 2 材料与方法28-36
• 2.1 材料28-29
• 2.1.1 试验动物及场地28
• 2.1.2 试验试剂28
• 2.1.3 试验仪器设备28-29
• 2.2 试验方法29-36
• 2.2.1 实验设计及处理29
• 2.2.2 样品采集及处理29-30
• 2.2.3 P4和E2的测定30-31
• 2.2.4 总RNA提取和反转录31-33
• 2.2.5 引物设计33-34
• 2.2.6 目的片段RT-PCR扩增和测序34
• 2.2.7 实时荧光定量PCR分析34-35
• 2.2.8 数据分析35-36
• 3 结果与分析36-44
• 3.1 总RNA质量检测36
• 3.2 等级卵泡TLRs的表达谱36-37
• 3.3 种鹅等级卵泡颗粒层和膜层TLRs家族基因的差异表达37-38
• 3.4 种鹅不同大小卵泡TLRs家族基因的差异表达38-40
• 3.5 LPS对种鹅卵巢卵泡外观形态的影响40
• 3.6 LPS对种鹅等级卵泡TLRs的影响40-42
• 3.7 LPS对种鹅P4、E2及其合成关键限速酶基因的影响42-44
• 4 讨论44-50
• 4.1 种鹅等级卵泡颗粒细胞和膜细胞TLRs家族基因的表达44-45
• 4.2 种鹅不同大小卵泡TLRs家族基因的表达45-46
• 4.3 LPS对卵巢卵泡外观形态及TLRs表达的影响46-48
• 4.4 LPS对种鹅P4、E2及其关键限速酶基因表达的影响48-50
• 5 结论50-51
• 6 参考文献51-61
• 7 致谢61-62
• 8 攻读学位期间发表论文情况62

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本文编号：835072