候选转基因靶标基因亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1突变体构建及功能分析

发布时间：2017-09-12 16:22

  本文关键词：候选转基因靶标基因亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1突变体构建及功能分析

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【摘要】：玉米是世界三大禾谷类作物之一,是重要的粮食、饲料和工业加工原料作物。近几年,随着我国玉米种植面积扩大和逐年连作,亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的为害逐渐加重,严重影响玉米产量。目前,我国转基因抗虫玉米研发工作正在进行中。丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitors, Serpins)是一种分布广泛的家族型蛋白酶抑制剂,该家族的大多数成员都对丝氨酸蛋白酶具有特异性抑制。迄今为止,现己从动物、病毒、植物、细菌和古生菌中发现1500多类丝氨酸蛋白酶抑制因子,该类抑制因子一般含有350～400个氨基酸残基,分子量约为40～100 kDa,并拥有一个包含8-9个a螺旋和3个p折叠的保守的三维结构。丝氨酸蛋白酶抑制剂通常在C端有一段暴露的反应中心(reactive centre loop)RCL序列,可以与丝氨酸蛋白酶共价结合,随后Serpin自身被裂解,RCL区域P1位点的氨基酸在serpin的结合过程中起关键作用。本文以亚洲玉米螟免疫相关的丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1为候选转基因靶标基因,进行P1位点定点突变,构建突变体并分析其表达产物的功能。本实验室已克隆获得Of-Serpin1全长为1336 bp的cDNA序列(登录号：.X524148),含一个1188 bp的开放阅读框,编码395个氨基酸残基,预测的分子量为43.3 kDa,其pI值为4.92,拥有一个典型的RCL功能区域。为探究P1位点在亚洲玉米螟serpin1功能中的作用,本文设计突变引物,将野生型P1位点的亮氨酸L360(CTA)突变为精氨酸R360(AGG)、赖氨酸K360(AAG)、苯丙氨酸F360(TTC)和丝氨酸S360(AGT),并在Serpin1氨基末端添加FLAG标签。将野生型和四种突变体Of-Serpin1的ORF克隆于pET-28b表达载体中,之后转入E.coli BL21(DE3)菌株进行体外原核表达。利用Ni2+亲和柱对野生型及四种突变体Serpin 1 (R、K、F、S)重组蛋白进行亲和纯化,利用Western blotting鉴定纯化获得的蛋白。对野生型及四种突变体Serpin1(R、K、F、S)重组蛋白进行抑制动力学分析。结果表明：添加Of-Serpinl S360(AGT)后牛胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的Vmax值和Km值最小,表示Of-Serpinl P1位点为S360时与chymotrypsin的亲和力最大,亲和力从大到小的Of-Serpin1 P1位点依次为S360K360p360L360R360。添加Of-serpin1 S360 (AGT)后chymotrypsin的K1值最小,表示Of-Serpin1 P1位点为S360时对chymotrypsin的抑制作用越强,抑制作用强度从大到小的Of-Serpin1 P1位点依次为S360K360F360L360R360。生物信息学分析表明Of-Serpin1类似于抗胰凝乳蛋白酶因子,但是Of-Serpin1野生型及四种突变体重组蛋白的选择性剪切实验结果证明,它们均可同时被牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶(.rypsin)剪切。
【关键词】：亚洲玉米螟 丝氨酸蛋白酶抑制因子 定点突变 原核表达 蛋白纯化 抑制动力学 选择性抑制
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.132
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 文献综述8-19
• 1 转基因玉米的研究现状8
• 2 昆虫的免疫防卫系统8-9
• 3 酚氧化酶原激活系统9-10
• 4 转基因候选基因丝氨酸蛋白酶抑制因子10-15
• 5 研究目的和意义15
• 参考文献15-19
• 1 前言19-20
• 2 材料与方法20-30
• 2.1 主要试剂20
• 2.2 主要仪器20-21
• 2.3 cDNA模板制备21-22
• 2.4 亚洲玉米螟幼虫Of-Serpin1基因突变体的构建22-27
• 2.4.1 系统进化树和多重序列比对确定P1位点22
• 2.4.2 引物设计与合成22
• 2.4.3 Of-Serpin1四种突变体基因的PCR扩增22-25
• 2.4.4 目的基因片段的回收纯化25
• 2.4.5 感受态细胞BL21的制备(CaCl_2法)25
• 2.4.6 Of-Serpin1四种突变体基因与表达载体连接25-27
• 2.4.7 Of-Serpin1四种突变体基因测序鉴定测序鉴定27
• 2.5 Of-Serpin1突变体(R、K、F、S)重组蛋白的原核表达27-30
• 2.5.1 重组表达条件优化27-28
• 2.5.2 表达的融合蛋白的纯化28-29
• 2.5.3 表达蛋白的Western blotting鉴定29-30
• 2.6 重组表达蛋白Of-Serpin1突变体蛋白的功能分析30
• 2.6.1 Of-Serpin1的抑制动力学30
• 2.6.2 不同丝氨酸蛋白酶对重组表达突变体蛋白Of-Serpin1的剪切活性分析30
• 3 结果与分析30-53
• 3.1 亚洲玉米螟幼虫Of-Serpinl基因序列分析及P1位点确定30-33
• 3.1.1 系统进化树和多重序列比对确定P1位点30-33
• 3.2 亚洲玉米螟幼虫Of-Serpin1突变体基因原核表达载体的构建33-38
• 3.2.1 引物设计与合成33
• 3.2.2 Of-Serpin1四种P1位点突变体基因全长cDNA的克隆33-35
• 3.2.3 Of-Serpin1突变体PCR产物割胶回收及表达载体构建35-36
• 3.2.4 Of-Serpin1(P1,R、K、F、S)四种突变体测序鉴定36-38
• 3.3 四种pET-28b-Of-Serpin1(P1,R、K、F、S)突变体原核表达条件的筛选38-40
• 3.4 Of-Serpin1突变体(R、K、F、S)重组蛋白的纯化与Western blotting鉴定40-42
• 3.5 重组表达蛋白Of-Serpin1野生型及突变体蛋白的功能分析42-53
• 3.5.1 重组表达蛋白Of-Serpin1野生型及其四种突变体(R、K、F、S)蛋白酶动力学分析42-50
• 3.5.2 不同丝氨酸蛋白酶对重组表达蛋白Of-Serpin1野生型及突变体蛋白的剪切活性分析50-53
• 4 讨论53-60
• 4.1 Of-Serpin1野生型和突变体的氨基酸序列和蛋白结构53-54
• 4.2 Of-Serpin1野生型和突变体蛋白的底物特异性54-55
• 4.3 Of-Serpin1的原核表达、纯化及Western blotting分析55-57
• 4.4 Of-Serpin1基因的蛋白功能57-60
• 4.4.1 体外重组蛋白Of-Serpin1的酶动力学分析57-58
• 4.4.2 不同丝氨酸蛋白酶对重组表达蛋白Of-Serpin1野生型和四种突变体蛋白的剪切活性分析58-60
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文64-65

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