两种乳杆菌比较基因组学研究及细菌素生物合成基因功能解析

发布时间：2017-09-12 19:10

  本文关键词：两种乳杆菌比较基因组学研究及细菌素生物合成基因功能解析

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【摘要】：乳杆菌是一类公认的益生菌,对人体的健康有极大的促进作用,如改善肠道菌群、增强免疫功能等。对乳杆菌的传统研究大部分往往基于理化实验抑或动物模型对其益生功能进行评价,而对内在的益生机理研究较少。随着基因组学的快速发展,测序技术不断升级且测序成本迅速下降,采用基因组学的方法研究微生物的基因功能变得越来越有效。基因组学可以从基因水平上研究乳杆菌的益生机理,这将为人类深入认识和了解乳杆菌揭开新的篇章。由于抗生素的广泛大量使用甚至滥用,超级抗药细菌越来越多,有必要发展新型抑菌物质来替代或部分替代抗生素,而细菌素有良好的潜质,乳杆菌细菌素是目前研究较多的一类细菌素。传统的细菌素研究方法大都从乳酸菌发酵液中分离纯化出抑菌活性物质,并对其进行结构和抗菌活性等功能鉴定,此方法繁琐且具有一定的随机性。随着越来越多的微生物基因组被测序,根据各类细菌素的结构特点,采用生物信息学方法从微生物全基因组序列信息中挖掘潜在细菌素基因已成为新型细菌素开发越来越有效的技术之一。本研究采用第二代高通量测序技术对实验室前期从热带芒果果实中筛选到的具有优良益生功能的一株植物乳杆菌L.plantarum FMNP01进行全基因组测序,采用生物信息学方法对全基因组序列进行分析,并将植物乳杆菌L.plantarum FMNP01的全基因组序列与实验室已经完成的全基因组测序的另一株乳杆菌L.sp FMNP02进行比较基因组学分析,以揭示这两株乳杆菌在分子进化、细菌素生物合成、蛋白质水解系统、糖代谢方面的基因组学机理。同时。采用实验生物学方法对这两株乳杆菌基因组中的潜在细菌素生物合成基因进行功能解析和鉴定。主要研究结果如下:(1)植物乳杆菌L.plantarum FMNP01全基因组测序结果表明,FMNP01菌株的基因组大小为3,313,644 bp,GC含量44.48%,共4个Scaffolds,18个Contigs。预测基因组含有3,147个基因,总长度为2,773,584 bp,占基因组全长的83.70%,平均基因长度881 bp,有64个tRNA,16个rRNA。(2)植物乳杆菌L.plantarum FMNP01和乳杆菌L.sp FMNP02的全基因组基本特征比较分析和基于16s rRNA序列构建的系统发生树分析结果表明,这两株乳杆菌的进化关系在乳杆菌属内相对较远,L.plantarum FMNP01与L.kimchii较为近缘,而L.sp FMNP02与L.casei较为近缘。(3)采用基因同源性和共线性分析方法对L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02进行比较分析,结果显示两者仅仅有1459个基因具有同源性,L.plantarum FMNP01有1688个基因为其特有,而L.sp FMNP02有1632个基因为其特有,说明两株乳杆菌之间的差异性较大,有近一半的基因为自己特有基因。共线性分析结果与基因同源性分析结果相符。(4)对L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02蛋白水解相关基因进行比较分析,结果显示L.sp FMNP02的肽类转运系统和肽酶数量均要多于L.plantarum FMNP01,推测L.sp FMNP02的蛋白水解能力要强于L.plantarum FMNP01。(5)对L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02的糖代谢相关基因进行分析,发现两者均编码大量的PTS转运系统蛋白,其中L.plantarum FMNP01编码58个,L.sp FMNP02编码69个。对L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02的糖转运PTS系统蛋白的分类进行了对比,结果显示L.plantarum FMNP01和L.sp FMNP02的PTS系统蛋白存在较大差异。(6)对L.plantarum FMNP01植物乳杆菌素的细菌素生物合成相关基因簇进行挖掘,发现L.plantarum FMNP01基因组中存在植物乳杆菌素的细菌素生物合成基因簇。该基因簇与植物乳杆菌WCFS1菌株的植物乳杆菌素生物合成基因簇对比分析结果表明,L.plantarumFMNP01的植物乳杆菌素生物合成基因簇比L.plantarumWCFS1菌株的植物乳杆菌素生物合成基因簇少了四个基因,分别是plnQ、plnI、plnF和plnS。采用大肠杆菌外源基因表达系统BL21[pET-32a(+)]表达L.plantarum FMNP01菌株的Ⅱb类细菌素植物乳杆菌素PlnJK,没有抑菌活性。(7)对L.sp FMNP02进行了Ⅱ类细菌素的基因挖掘,得到28个潜在的Ⅱ类细菌素基因序列。采用大肠杆菌外源基因表达系统BL21[pET-28a(+)]对L.sp FMNP02菌株基因组中潜在Ⅱb类细菌素基因序列F1和F2进行表达,F1基因表达产物F1-28a能够抑制副溶血弧菌等,F2基因表达产物F2-28a能够抑制大肠杆菌等。
【关键词】：乳杆菌 全基因组测序 比较基因组学 细菌素 基因发掘
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文缩略语及中文对照8-13
• 1 绪论13-27
• 1.1 乳杆菌13-15
• 1.1.1 乳杆菌简介13
• 1.1.2 乳杆菌的活性功能13-15
• 1.1.3 乳杆菌的应用15
• 1.2 乳杆菌基因组学研究现状15-21
• 1.2.1 微生物基因组学简介15-17
• 1.2.2 微生物基因组学研究方法17-19
• 1.2.3 乳杆菌基因组学研究概况19-21
• 1.3 细菌素研究进展21-25
• 1.3.1 细菌素简介与分类21-22
• 1.3.2 细菌素的抑菌机理22-23
• 1.3.3 细菌素的应用23-24
• 1.3.4 乳酸菌细菌素研究概况24-25
• 1.4 本研究的目的与意义25-27
• 1.4.1 本研究的目的与意义25-26
• 1.4.2 研究内容26-27
• 2 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02的比较基因组学研究及细菌素相关基因的挖掘27-54
• 2.1 研究对象及方法27-31
• 2.1.1 研究对象27
• 2.1.2 L. plantarum FMNP01的培养与基因组DNA的提取27
• 2.1.3 基因组测序、组装及基因组注释27
• 2.1.4 基因组同源性分析27-28
• 2.1.5 基因组共线性分析28
• 2.1.6 系统发生树构建28-29
• 2.1.7 细菌素基因挖掘方法29-30
• 2.1.8 所用到相关软件和数据库30-31
• 2.2 结果与分析31-51
• 2.2.1 L. plantarum FMNP01的全基因组测序及初步生物信息分析31-39
• 2.2.2 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02基因组基本特征比较及系统分类39-41
• 2.2.3 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02的基因组同源性比较41-45
• 2.2.4 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02蛋白水解相关基因的比较分析45-48
• 2.2.5 L. plantarum FMNP01和L. sp FMNP02糖代谢相关基因的比较分析48-49
• 2.2.6 L. sp FMNP02细菌素相关基因的挖掘以及Ⅱ类细菌素的预测49-51
• 2.3 小结51-54
• 3 Pln J和Pln K原核表达菌株的构建及表达54-67
• 3.1 材料与方法54-61
• 3.1.1 菌株与质粒54
• 3.1.2 培养基和试剂54-55
• 3.1.3 主要仪器设备55
• 3.1.4 Pln J和Pln K的克隆55-59
• 3.1.5 诱导表达培养59-60
• 3.1.6 重组蛋白的纯化及抑菌活性检测60-61
• 3.2 结果与分析61-65
• 3.2.1 Pln J-T和Pln K-T克隆载体的构建61-63
• 3.2.2 Pln J-p ET32a和Pln K-p ET32a表达载体的构建63-64
• 3.2.3 重组大肠杆菌Pln J-p ET32a和Pln K-p ET32a的诱导表达64
• 3.2.4 重组蛋白Pln J-p ET32a和Pln K-p ET32a的纯化及抑菌活性检测64-65
• 3.3 小结65-67
• 4 F1和F2原核表达菌株的构建及表达67-76
• 4.1 材料与方法67-71
• 4.1.1 菌株与质粒67
• 4.1.2 培养基和试剂67
• 4.1.3 主要仪器设备67
• 4.1.4 F1和F2的克隆67-70
• 4.1.5 诱导表达培养70-71
• 4.1.6 重组蛋白的抑菌活性检测71
• 4.2 结果与分析71-75
• 4.2.1 F1-T和F2-T克隆载体的构建71-73
• 4.2.2 F1-p ET28a和F2-p ET28a表达载体的构建73
• 4.2.3 重组大肠杆菌F1-p ET28a和F2-p ET28a的诱导表达73-74
• 4.2.4 重组蛋白F1-p ET28a和F2-p ET28a的抑菌活性检测74-75
• 4.3 小结75-76
• 5 全文讨论76-78
• 5.1 L. plantarum FMNP01与L. sp FMNP02的比较基因组学研究76
• 5.2 细菌素Pln J和Pln K的异源表达与活性验证76-77
• 5.3 Ⅱ类细菌素的预测与FI和F2的活性验证77-78
• 6 全文结论与展望78-80
• 6.1 全文结论78-79
• 6.2 展望79-80
• 致谢80-82
• 参考文献82-93
• 附录A L. plantarum FMNP01 PTS糖转运系统93-97
• 附录B L. sp FMNP02 PTS糖转运系统97-101
• 附录C 硕士在读期间发表的文章101

【参考文献】

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1 林n，

本文编号：839001