山楂矢车菊素-3-O-半乳糖基转移酶基因筛

发布时间：2017-09-13 19:28

  本文关键词：山楂矢车菊素-3-O-半乳糖基转移酶基因筛选、克隆及功能验证

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【摘要】：花色苷是广泛分布于自然界的一种水溶性植物色素,具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、防治心血管疾病等多种生物活性。花色苷易受光照、温度、pH值影响,分离纯化花色苷单体比较困难,导致花色苷对照品市场售价极高；还有些种类的花色苷由于在植物中含量极低,无法通过化学分离的手段得到。生物合成技术为大量获得有效成分提供了新的思路,近年来有关花色苷生物合成与调控机制的研究已在玉米、拟南芥、葡萄、苹果等植物中取得了进展。山楂(山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br或山楂C. pinnatifida Bge.)是传统中药,近年来常用于心血管疾病的治疗,其药效与山楂中所含的黄酮类成分密切相关。课题组前期研究表明,山楂果实中花色苷类成分主要为矢车菊素-3-O-半乳糖苷(Cyanidin-3-O-galactoside, Cy-3-O-Gal)和矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷,且这两种成分含量低,单体的提取分离比较困难。本研究拟将化学分析和分子生物学技术相结合,对山楂中花色苷类成分进行研究,旨在获得山楂果实花色苷生物合成的关键酶及其编码基因,为通过生物合成的手段获得花色苷类成分奠定基础。研究内容主要分为4个部分。第一章为文献综述一方面,对山楂化学成分及成分分析方面的报道进行分析整理,为开展不同发育期山楂果实有效成分变化规律提供了技术参考；另一方面,综述了花色苷类成分提取分离、成分分析、药效活性以及生物合成等方面的研究,研究表明花色苷类成分有良好的药效活性及应用价值,仅依靠化学分离技术已不能满足花色苷的应用需求,急需一种高效的获得花色苷类成分的方法；另外,有关花色苷类成分生物合成方面的研究已经有大量的研究基础,为今后开展山楂果实花色苷类成分的合成生物学研究奠定了良好的基础。第二章为不同发育期山楂果实有效成分含量变化规律研究采用正交设计实验对山楂样品制备方法进行优化,建立了山楂果实中表儿茶素、原花青素B2 (Procyanidin B2, PC B2)、金丝桃苷、异槲皮苷、绿原酸、熊果酸、Cy-3-O-Gal7种化学成分的含量测定方法,并对不同发育期山楂果实中这7种成分进行了含量测定。结果表明,在山楂果实发育过程中表儿茶素、PCB2、金丝桃苷、异槲皮苷、绿原酸、熊果酸、Cy-3-O-Gal含量(干燥重量,Drymass, DM)变化范围分别为4.932～19.315 mg/g、2.218～14.549 mg/g、0.066～0.184 mg/g、0.053～0.117 mg/g、0.532～1.834 mg/g、2.163～5.942 mg/g、0.005～0.188 mg/g。花色苷含量在果实即将成熟时迅速增加,在成熟时达到最大值,表儿茶素和PCB2则与花色苷变化趋势不同,在果实趋向成熟的阶段其含量逐渐减少。第三章为山楂果实花色苷生物合成途径关键酶基因的筛选本研究以不同发育期山楂果实为研究材料,以改良CTAB法提取山楂果实总RNA,并进行转录组高通量测序,同时采用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-PCR),对花色苷生物合成途径12个基因家族的28个基因在山楂果实发育过程中的表达模式进行分析。结果显示Cp4CL2、Cp4CL3、 Cp4CL4、Cp4CL5、CpCHI1、CpCHI2、CpCH3、CpF3H1、CpF3'5'H1、CpF3'5'H2、 CpF3'5'H3、CpF3'5'H4、CpF3'5'H5、CpLDOXl和Cp3OGT基因与花色苷成分有显著的正向相关关系,预示着上述基因可能是参与山楂果实花色苷生物合成的关键酶基因,为花色苷的生物合成提供了参考资料。第四章为山楂果实Cp3OGT基因的克隆和功能分析本研究从山楂果实转录组中获得Cp3OGT基因序列,设计特异性引物,克隆该基因全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析及基因表达模式分析。结果表明,Cp3OGT基因完整的ORF开放阅读框位于38-1486 bp,编码482 aa的蛋白质,分子量约为52 KDa；该蛋白具有“UDPGT'’的结构功能域,基因表达分析表明Cy-3-O-Gal含量与Cp3OGT基因相对表达量呈显著正相关,相关系数达到0.8513。为了验证其功能,将重组的pET28a-Cp3OGT载体转入大肠杆菌进行原核表达,采用经过SDS-PAGE电泳鉴定正确的蛋白用于体外酶促反应。然后采用液质联用技术对酶促反应产物进行鉴定,通过比对保留时间和离子对数据,明确酶促反应产物为Cy-3-O-Gal,表明Cp3OGT蛋白具有催化矢车菊素合成Cy-3-C-Gal的活性。综上所述,本文建立了山楂果实7种成分的HPLC含量测定方法,对不同发育期山楂果实中有效成分含量变化规律进行研究；首次研究了山楂果实花色苷生物合成途径相关基因的表达情况,并结合其与化学成分含量的相关性,预测了可能的关键酶基因,并进一步从山楂果实中克隆关键酶Cp3OGT基因全长,并对其功能进行鉴定,为解析山楂果实中花色苷类成分的生物合成途径和合成生物学研究提供了参考资料。
【关键词】：山楂 成分分析 花色苷 矢车菊素-3-O-半乳糖苷转移酶 功能验证
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;Q946
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 缩略语中英文对照表13-14
• 前言14-15
• 第一章 文献综述15-27
• 1.1 山楂化学成分研究进展15-20
• 1.1.1 山楂化学成分概述15-16
• 1.1.2 山楂化学成分分析研究现状16-20
• 1.2 花色苷类成分研究进展20-27
• 1.2.1 花色苷提取分离研究现状20-22
• 1.2.2 花色苷类成分分析研究现状22-23
• 1.2.3 花色苷类成分的药效活性23-24
• 1.2.4 花色苷生物合成研究概况24-27
• 第二章 不同发育期山楂果实有效成分含量变化规律研究27-42
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 样品的收集27
• 2.1.2 仪器与试剂27-28
• 2.2 方法与结果28-40
• 2.2.1 HPLC色谱条件28
• 2.2.2 供试品溶液的制备28-29
• 2.2.3 色谱峰的定性29-30
• 2.2.4 线性关系考察30-31
• 2.2.5 样品溶液制备方法考察31-34
• 2.2.6 方法学考察34-38
• 2.2.7 不同发育期山楂果实有效成分含量测定38-40
• 2.3 讨论40-42
• 2.3.1 花色苷分析方法的优化40
• 2.3.2 不同发育期山楂果实有效成分含量变化规律40-42
• 第三章 山楂果实花色苷生物合成途径关键酶基因的筛选42-62
• 3.1 材料42-43
• 3.1.1 植物材料42
• 3.1.2 仪器与试剂42-43
• 3.2 方法43-50
• 3.2.1 山楂果实总RNA的提取及检测43-44
• 3.2.2 De novo转录组高通量测序及分析44-46
• 3.2.3 第一链cDNA合成46-47
• 3.2.4 关键酶基因分析47-48
• 3.2.5 引物设计48
• 3.2.6 RT-PCR测定基因表达量48-49
• 3.2.7 数据分析49-50
• 3.3 结果与分析50-59
• 3.3.1 山楂果实总RNA提取结果50
• 3.3.2 转录组高通量测序50-52
• 3.3.3 花色苷合成关键酶基因分析52-55
• 3.3.4 不同发育期山楂果实基因表达量分析55-58
• 3.3.5 山楂果实基因表达与化学成分的关系58-59
• 3.4 讨论59-62
• 3.4.1 山楂果实总RNA提取59-60
• 3.4.2 花色苷生物合成相关基因60-62
• 第四章 山楂果实Cp3OGT基因的克隆和功能分析62-75
• 4.1 材料62-63
• 4.1.1 仪器62
• 4.1.2 试剂62-63
• 4.2 方法与结果63-73
• 4.2.1 山楂果实Cp3OGT基因cDNA全长克隆63-65
• 4.2.2 Cp3OGT基因cDNA的生物信息、学分析65-70
• 4.2.3 重组蛋白诱导表达70
• 4.2.4 酶粗提物的制备70-71
• 4.2.5 Cp3OGT体外酶促反应71-72
• 4.2.6 反应产物LC-MS鉴定72-73
• 4.3 讨论73-75
• 第五章 全文小结75-77
• 参考文献77-83
• 致谢83-84
• 个人简历84

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本文编号：845465