甲醛代谢关键基因Anfaldh对植物遗传转化的研究

发布时间：2017-09-13 20:51

  本文关键词：甲醛代谢关键基因Anfaldh对植物遗传转化的研究

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【摘要】：甲醛是主要室内空气污染物,可能引起人体急性或慢性中毒。通过植物来去除甲醛污染是最简单、最自然、最环保的方式,但是植物吸收和代谢甲醛的能力远不能达到实际使用的要求。本研究在烟草中过表达抗甲醛真菌Aspergillus nomius SGFA1中的依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶基因(Anfaldh),尝试利用基因工程的方法来提高植物去除甲醛的能力。主要研究内容如下:1.构建pBI121-Anfaldh植物表达载体,并对植物进行遗传转化构建了植物过表达载体pBI121-Anfaldh。通过农杆菌介导法转化烟草,对50株卡那霉素筛选得到的植株进行PCR鉴定,得到27株PCR阳性植株。2.转基因植株的分子生物学鉴定对转基因植株进行q PCR鉴定,结果发现转基因植株的Anfaldh基因表达量是野生型(WT)的3.6-14倍,其中三个转基因株系(Anfaldh4、Anfaldh40、Anfaldh130)具有较高的转录水平,其中转基因植株Anfaldh4的基因表达量最高。3.转基因植株的FALDH酶活性分析通过酶活性检测分析显示,在340 nm波长下,转基因植株在单位时间内能产生更多的NADPH。Anfaldh4、Anfaldh40、Anfaldh130、WT中FALDH酶活性分别为0.429、0.392、0.345和0.195 U/mg蛋白。转基因植株的酶活性均有一定程度的提高,是WT的1.8-2.2倍,结果表明Anfaldh基因在转基因株系中过量表达,且产物具有生物活性。4.甲醛胁迫下转基因植株的表型检测在含4 mM甲醛的平板上,处理3天后WT植株全部白化死亡,转基因植株能够正常生长。处理6-7天后,转基因植株叶片开始膨大,最终转基因植株能够分化获得不定芽。用4 mM气体甲醛处理3天,转基因植株表现出比野生型植株更好的生长。WT几乎所有的叶子变黄枯萎,而大多数转基因植株的叶片仍然保持绿色,说明Anfaldh过表达植株降解甲醛能力强于WT。5.甲醛胁迫下转基因植株的生理检测甲醛胁迫下,丙二醛含量明显上升,但转基因植株的丙二醛(MDA)含量显著低于WT。在叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量方面,转基因植株均高于WT。生理水平分析表明Anfaldh过表达植株对HCHO胁迫的耐受性强于野生型植株。6.转Anfaldh基因烟草的代谢甲醛能力检测在2 mM甲醛水溶液中,处理72 h后,转基因植株Anfaldh4将水溶液中93%的甲醛代谢完全,而WT植株甲醛水溶液中仍有62%甲醛剩余。和WT植株相比,转基因植株的甲醛代谢能力是WT的1.4-2.5倍。在气体甲醛环境中,转基因植株的单位面积代谢气体甲醛的能力是野生型的1.9-2.37倍。甲醛吸收实验证明,转基因植株的吸收甲醛能力强于WT植株。
【关键词】：甲醛 真菌Aspergillus nomius SGFA1 依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶基因(Anfaldh) 植物修复 烟草
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 绪论10-16
• 1.1 环境污染概述10
• 1.2 室内空气污染概述10-11
• 1.3 甲醛的来源及危害11-12
• 1.3.1 甲醛的来源11
• 1.3.2 甲醛对人体的危害11
• 1.3.3 我国目前甲醛室内污染现状11-12
• 1.4 室内甲醛污染的治理方法12-13
• 1.4.1 通风换气法12
• 1.4.2 物理修复技术12
• 1.4.3 植物对甲醛的代谢与转化12-13
• 1.5 依赖谷胱甘肽的甲醛代谢途径13
• 1.6 利用基因工程方法提高植物代谢甲醛能力研究13-15
• 1.7 研究的目的与意义15-16
• 第2章 Anfaldh基因对烟草的遗传转化16-34
• 2.1 引言16
• 2.2 实验材料16
• 2.3 实验仪器及药品16-19
• 2.4 实验方法19-28
• 2.4.1 Anfaldh表达载体的构建19-24
• 2.4.2 烟草的遗传转化24-25
• 2.4.3 转基因烟草的分子生物学检测25-27
• 2.4.4 植物FALDH酶活性测定27-28
• 2.4.5 试验数据的统计分析28
• 2.5 实验结果28-33
• 2.5.1 p BI121-Anfaldh植物表达载体的构建28-30
• 2.5.2 Anfaldh基因对烟草的遗传转化30-31
• 2.5.3 转基因烟草的分子生物学检测31-32
• 2.5.4 FALDH酶活性测定32-33
• 2.6 本章小结33-34
• 第3章 转基因烟草的甲醛代谢能力分析34-43
• 3.1 引言34
• 3.2 实验材料34
• 3.3 实验方法34-36
• 3.3.1 转基因烟草对甲醛抗性表型检测34
• 3.3.2 转基因烟草经甲醛处理后生理指标的变化34-36
• 3.3.3 转基因烟草代谢甲醛能力检测36
• 3.4 实验结果36-42
• 3.4.1 转基因烟草对甲醛抗性表型检测36-37
• 3.4.2 转基因烟草经甲醛处理后生理指标的变化37-41
• 3.4.3 转基因烟草代谢甲醛能力的分析41-42
• 3.5 本章小结42-43
• 第4章 讨论43-46
• 4.1 甲醛代谢相关基因的研究43-44
• 4.2 甲醛对植物造成的氧化损伤44
• 4.3 转基因植株的甲醛代谢能力分析44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-54
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文54-55
• 致谢55-56

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本文编号：845841