紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测

  本文关键词：紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测，由笔耕文化传播整理发布。

１８２－１８９

２月２０１２年１　　　草　业　学　报　　　

ＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　　　　Ａ　　第２１卷　第６期

Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６

紫花苜蓿ＭｓＺＩＰ基因超表达载体的

构建及转基因苜蓿检测

李燕１，孙彦２，杨青川１＊，康俊梅１，张铁军１，房锋３

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１中国农业大学动物科技学院，北京１１．００１９３；２．００１９１；

）中国农业科学院植物保护研究所，北京１３．００１９３

，摘要：根据已经克隆得到的Ｍ扩增编码区ｃ构建植物超表达载体ｓＺＩＰ基因（ＧｅｎＢａｎｋ序列号：ＨＱ９１１７７８）ＤＮＡ，目的基因已经正确的插入到载体中，超表达载体构建成功。采用ＣＰＢＩｓＺＩＰ。酶切鉴定表明，ａＣｌ－Ｍ２冻融法将其转入农杆菌菌株中，然后采用农杆菌介导的方法，转化紫花苜蓿，共得到１对其中的４株进行卡那霉素基１株抗性苗，因Ｐ均得到了目的条带。同时对这４株抗性苗进行目的基因的Ｒ均得到了目的条带。说明ＣＲ检测，Ｔ－ＰＣＲ检测，／／分别用２ＭｓＺＩＰ基因已经成功在苜蓿中超表达。为了进一步验证该基因的功能，００ｍｍｏｌＬＮａＣｌ和２５μｍｏｌＬ　ＰＥＧ６０００处理转基因苜蓿，３ｄ后进行生理指标的测定。结果表明，ＭｓＺＩＰ基因在苜蓿中超表达可以提高苜蓿的－耐盐性和耐旱性。

关键词：紫花苜蓿；超表达载体；苜蓿转化；转基因苜蓿检测ＭｓＺＩＰ基因；

＋

（）中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１．１０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９２０１２０６０１８２０８－－－

＊

对于植物的研究已经深入到分子水平，侧重于从分子角度阐明植物各种生理反应机　　随着生物技术的发展，

理，分子机制，以及基因水平的调控。在培育植物新品种，提高植物抗逆性方面，植物转基因技术已经成为近年来

１］

。在目前的植物转基因育种中，研究的重点内容之一。转基因育种也成为了苜蓿新品种培育的一项重要手段［

主要采用的技术有农杆菌介导法，微注射法，电击法和基因枪法。在紫花苜蓿（的育种工作中，Ｍｅｄｉｃａｏｓａｔｉｖａ）　ｇ农杆菌介导法成为主要的方法，首例农杆菌介导的苜蓿转化获得成功，之后又建立了紫花苜蓿的遗传转１９８６年，

［］２，３］

，化体系［苜蓿转基因工作获得了很大的进展。在苜蓿中，已经有很多抗逆相关的基因被分离，Ｂｒｏｕｗｅｒ等４将

的Ｍ发现转基因植物Ｓ烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）ｎＳＯＤｃＤＮＡ导入苜蓿中，ＯＤ活性增强，２轮的田间试验鉴定　－　

［］

转基因苜蓿的抗寒性明显提高。２增强了盐诱导的表明，０００年Ｗｉｎｉｃｏｖ和Ｂａｓｔｏｌｄ５将Ａｌｉｎｌ基因导入苜蓿中，ｆ［］

在植株的生长过程中其耐盐性得到了提高，并且生长速度加快。ＭＭｓＰＲＰ２基因的表达，ｕｎｎｉｋ等６从紫花苜蓿

）路径第一个关键酶基因Ｓ中分离出了ＭＡ序列分析结果表明，它与ＰＫ（ｍｉｔｏｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｎａｓｅＩＭＫ，ｒｏｔｅｉｎ－　　ｇｐ中的ＭＡ盐胁迫下其体内的表达水平上调。２拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ＰＫ基因具有极大的相似性，０１１年，　ｐ

７］

江藤等［对蒺藜苜蓿（全基因组ＷＲ发现蒺藜苜蓿中含有２Ｍｅｄｉｃａｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）ＫＹ转录因子进行了分析，８个　ｇ

同时将这些基因与水稻（的ＷＲＫＹ基因进行了比较分析，为研究苜蓿的ＷＲＷＲＫＹ基因，Ｏｒｚａｓａｔｉｖａ）ＫＹ转　ｙ

８］

将抗冻基因Ｃ成功得到和田苜录因子提供了重要的理论依据。刘晓静等［ＢＦ２构建表达载体并转化和田苜蓿，９］

蓿的愈伤组织。燕丽萍等［采用分子生物学检测和不同浓度的ＮａＣｌ对转ＢＡＤＨ基因苜蓿Ｔ１代２个株系进行

遗传稳定性和抗盐性研究，结果表明，转入的Ｂ转基因苜蓿耐盐性明显高于对照。蒋ＡＤＨ基因可以稳定遗传，

１０］世翠等［将α成功得到了表达α为苜蓿作为植物生ＦＧＦ基因构建表达载体并转化紫花苜蓿，ＦＧＦ基因的苜蓿，

物反应器奠定了理论基础。

紫花苜蓿是分布最广的一种牧草，它的适应性很强，是世界上种植面积最广的一种牧草。但是干旱胁迫和高盐胁迫却是影响苜蓿生长的主要因素，为了从分子机理上解决这一问题，越来越多的盐诱导基因已经从苜蓿中分

；改回日期：２０１１１２０５２０１２０１１１＊收稿日期：－－－－

“））基金项目：十二五＂国家科技支撑计划课题（和中央级公益性科研院所专项资金项目（资助。２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１０１３２０１１ｃ１４－－－ｊ，：作者简介：李燕（女，蒙古族，内蒙古乌兰察布人，博士。Ｅ－ｍ１９８４ａｉｌｃａａｓｌｉａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ－）ｙ

：ｃｈａｎ６６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎａｉｌ＊通讯作者。Ｅ－ｍｑｙｇ

［３］１１，１２］

。Ｄ离出来，在烟草中超表达可以增强烟草的耐盐性［从耐盐苜蓿ｃｅｕｔｃｈ和Ｗｉｎｉｃｏｖ１ＤＮＡ文库筛选到一个

新ｃ称作ＭＳ研究表明该基因与紫花苜蓿富含脯氨酸的细胞壁蛋白转录后盐调节表达ＤＮＡ克隆，ＰＲＰ２９基因，

［４］

有关，能够通过提高耐盐苜蓿中的脯氨酸含量来提高苜蓿的耐盐性。Ｂ用差异显示法从菟丝子ｏｒｓｉｃｓ和Ｌａｄｏｓ１

（，侵染的紫花苜蓿中克隆出一个与钙调蛋白相关的基因Ｐ在高盐、渗透、低温以及ＡＣｕｓｃｕｔａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＰＲＧｌＢＡ　

［１５］处理下，ＰＰＲＧｌ转录水平快速上调。ＧｉｎｚｂｅｒＤＮＡ文库中成功克隆出２个编码ｇ等从盐胁迫的紫花苜蓿根ｃ

两者的转录水平在盐胁迫下显著增加。本实验室Ｐｒｏ关键的合成酶基因ｃＤＮＡ克隆，ＭｓＰ５ＣＳ１和ＭｓＰ５ＣＳ２，－－

１６］

。从耐盐苜蓿中克隆得到的锌指蛋白基因Ｍ在盐诱导下，表达量也显著升高［ｓＺＦＮ，

本试验构建植物超表达载体Ｐ并采用农杆菌介导的方法将目的基因ＭＢＩｓＺＩＰ，ｓＺＩＰ转入苜蓿中。成功－Ｍ获得了转基因苜蓿苗，其后的生理指标检测表明，在苜蓿中超表达Ｍ可以提高苜蓿的耐盐性，为研究ｓＺＩＰ基因，该基因的功能以及苜蓿新品种的选育提供依据。１　材料与方法１．１　试验材料

耐盐品种紫花苜蓿中苜１号由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成，本实验室保存种子。本试验于，／无菌水洗净，放置在１２０１１年进行。选取饱满健康的种子用７５％乙醇灭菌１０ｍｉｎ０．１％升汞灭菌７ｍｉｎ后，２于２ＭＳ固体培养基上，５℃培养箱培养。

克隆载体ＰＭＤ实验所需的各种限制性内切酶和Ｔ用于构建超表达载１８ＮＡ连接酶购自Ｔａｋａｒａ公司，－Ｔ，４Ｄ体的原始质粒ＰＢＩ１２１和农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４由本实验室保存。大肠杆菌感受态ＤＨ５α购自北京全式金生物胶回收试剂盒，技术公司。质粒小提试剂盒，Ｔｒｉｚｏｌ购自北京博迈德生物公司。其他生化试剂均购自北京康博顺达生物有限公司。

１．２　ＭｓＺＩＰ编码区ｃＤＮＡ的获得

根据已经得到的Ｍ设计１对带有酶切位点的引物：ｓＺＩＰ基因序列，ＭＦ：５′ＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴ－；ＭＲ：。酶切位点用下划线表示，。提分别为ＸＧＡＧ３′５′ＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＡＧＣＡＡＣ３′ｂａＩ和ＢａｍＨＩ－Ｇ－取紫花苜蓿总Ｒ反转录成ｃ进行Ｐ切ＮＡ，ＤＮＡ作为模板，ＣＲ扩增。ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析后，胶回收，连接到克隆载体ＰＭＤ命名为ＰＭＤ－Ｍ转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落，菌体Ｐ１８ｓＺＩＰ，ＣＲ检测之－Ｔ上，将含有目的条带的阳性克隆送到北京华大基因生物技术有限公司测序。后，

１．３　超表达载体的构建

选取测序完全正确的阳性菌提取质粒，用限制性内切酶ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切质粒ＰＭＤ－ＭｓＺＩＰ和琼脂糖凝胶检测后各自回收目的片段，用ＴＰＢＩ１２１，ＮＡ连接酶，１６℃连接６ｈ。连接好的载体命名为ＰＢＩ－４Ｄ转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落，提取质粒，ＭｓＺＩＰ，ＰＣＲ检测后送阳性克隆测序。将含有阳性克隆的菌落，ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切鉴定。１．４　转基因苜蓿的获得

将构建好的超表达载体采用Ｃ用于苜蓿的转化。苜蓿种子灭菌后播种在无菌ａＣｌ２冻融法转入农杆菌中，／／／切下子叶，转入预培养培养基（１２ＭＳ培养基，２５℃培养箱中培养７ｄ后，２，４２．０ｍＬ＋ＫＴ０．２５ｍＬ＋－Ｄ　　ｇｇ中培养２ｄ后，将子叶浸泡在Ｏ摆放在共培养培ＵＭ）Ｄ０．５的农杆菌转化菌液中１０ｍｉｎ。取出后吸干菌液，６００＝／／，／养基上（黑暗培养４２，４２．０ｍＬ＋ＫＴ０．２５ｍＬ＋ＵＭ）８ｈ。之后转入诱芽培养基（５０ｍＬＫａｎ＋３００－Ｄ　　　ｇｇｇ／／／，直至形成愈伤组织，出现再生芽。当再生芽长至１ｃｍＬＣｅｆ＋２．０ｍＬ２，４０．２５ｍＬ＋ＵＭ）ｍ左　　－Ｄ＋ＫＴ　ｇｇｇ／将芽切下，转入１地上部分长至１转右时，２ＭＳ培养基中生根培养。当再生苜蓿苗根长至１０ｃｍ，０ｃｍ左右时，温室中继续培养。入营养土中，１．５　再生植株的检测

设计１对载体ＰＢＩｓＺＩＰ上的引物ＮＰＴ１：５′ＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧ３′和ＮＰＴ２：５′ＣＴ－Ｍ－ＡＴＡ－－－

［７］

，用于扩增卡那霉素抗性基因ＮＰ提取转基因抗ＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴ３′ＴⅡ。实验室改进的ＣＴＡＢ法１－

性苜蓿苗的基因组Ｄ质粒Ｐ进行ＰＮＡ作模板，ＢＩ１２１和未转基因苜蓿ＤＮＡ分别作为阳性和阴性对照，ＣＲ扩增。

ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析。

，以ＭＦ和ＭＲ为引物，用于扩增目的基因。Ｔ参见说明书）反转ｒｉｚｏｌ法提取转基因抗性苜蓿苗的总ＲＮＡ（录产物作为模板，质粒Ｐ进行ＲＢＩｓＺＩＰ和ＰＢＩ１２１分别为阳性对照和阴性对照，Ｔ－ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物在１％－Ｍ琼脂糖凝胶上电泳分析。

／／分别用２可溶性糖００ｍｍｏｌＬＮａＣｌ和２５μｍｏｌＬＰＥＧ６０００处理转基因苜蓿，３ｄ后测量可溶性蛋白含量，　　－

１８］

。每个样品都做３次重复，含量，相对含水量，丙二醛含量以及脯氨酸含量［测量结果用ＳＡＳ９．０数据分析软件　

在Ｐ＜０．０５水平进行统计分析。２　结果与分析

２．１　ＭｓＺＩＰ基因ｃＤＮＡ序列的获得

以紫花苜蓿总Ｒ进行ＰＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ为模板，ＭＦ和ＭＲ为引物，ＣＲ扩增。得到１条长约１０００　。将Ｐ图１）连接到载体ＰＭＤ转化大肠杆菌，将ＰｂＣＲ产物切胶回收后，１８ＣＲ鉴定的阳性克隆－Ｔ上，ｐ的条带（

测序，结果表明序列正确无误，没有碱基突变和移码突变，成功的克隆得到ＭｓＺＩＰ基因。２．２　超表达载体ＰＢＩｓＺＩＰ构建－Ｍ

提取构建好的质粒Ｐ用限制性内切酶ＸＢＩｓＺＩＰ，ｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳得到１条约－Ｍ），图２与预期大小相符，表明植物超表达载体Ｐ１０００ｂＢＩｓＺＩＰ构建成功

。　－Ｍｐ的条带（

图１　ＭｓＺＩＰ编码区ｃＤＮＡ的克隆Ｆｉ．１　ＣｌｏｎｉｎｏｆｃｏｄｉｎｒｅｉｏｎｏｆＭｓＺＩＰ　　　ｇｇｇｇ　　

；Ａ：目的Ｍ：ＤＮＡ标记ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ

片段Ｃｏｄｉｎｒｅｉｏｎ

．ｇｇ　

图２　超表达载体的酶切鉴定

Ｆｉ．２　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｅｄｖｅｃｔｏｒｓ　　　　ｇｐ

；Ｍ：ＤＮＡ标记ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒＰ：ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ双酶切后

的质粒ＴｈｅｌａｓｍｉｄｄｉｅｓｔｅｄｂＸｂａＩａｎｄＢａｍＨＩ．　　　　　ｐｇｙ　

２．３　紫花苜蓿再生植株转化

，经过农杆菌转化的苜蓿子叶，在诱芽培养基上生长３形成愈伤组织（图３继续培养６可见０ｄ后，Ａ）０ｄ之后，，在愈伤组织上出现绿色的出芽点，开始形成再生芽（图３当再生芽长到１ｃ将再生芽切下，，转入生根Ｂ）ｍ左右时，，，培养基中培养（图３再生植株成苗后，根长１地上部分１图３即可转入营养土中，在温室Ｃ）０ｃｍ，０ｃｍ左右时（Ｄ）。中继续培养（图３Ｅ）２．４　再生植株ＰＣＲ鉴定

从获得的１选取４株进行卡那霉素抗性基因的鉴定。Ｐ１株抗性植株中，ＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶电泳上分），图４与目的大小一致。同时对这４株抗性苗进行目的基因的析这几株再生苗均得到长为４００ｂｐ左右的条带（），得到了约为１图５与目的大小一致。证明这４株ＲＴＰＣＲ检测，１％琼脂糖凝胶电泳结果表明，０００ｂ－　ｐ的条带（转基因苜蓿转化成功。

第２１卷第６期草业学报２０１２年１８５

图３　苜蓿转基因苗的再生Ｆｉ．３　Ａｌｆａｌｆａｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｌａｎｔｓ　　ｇｇｐ

；；；Ａ：愈伤组织ＣａｌｌｕｓＢ：开始产生再生芽ＲｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓＣ：再生芽Ｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓ　　ｇｇ

；Ｄ：再生根ＲｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｏｏｔｓＥ：抗性苗Ｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｅｄｌｉｎ．　　ｇｇｇ

图４　再生植株卡那霉素抗性基因检测ｅｎｅｌａｎｔｓＦｉ．４　ＮＰＴⅡｇｔｅｓｔｉｎｏｆｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎ　　　ｐｇｇｇ　

；；；再生植株Ｒ１～４：ｅｅｎｅｒａｔｉｏｎＣＫ＋：阳性对照ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＣＫ－：阴性对照Ｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ

．ｌａｎｔｓ　　　ｇｇｐ

图５　再生植株ＭｓＺＩＰ目的基因检测Ｆｉ．５　ＭｓＺＩＰｇｅｎｅｔｅｓｔｉｎｏｆｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｌａｎｔｓ　　　ｇｇｇｐ　

；；；阴性对照Ｎ１～４：再生植株ＲｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｌａｎｔｓＣＫ＋：阳性对照ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＣＫ－：ｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．　　　ｇｐｇ

２．５　再生植株生理指标测定

在干旱和高盐处理之后，可溶性糖含量均增加，转基因苜蓿中高于未转基苜蓿，干旱处理后的增加量高于盐；；处理（图６可溶性蛋白的含量也有所增加（图６相对含水量测定结果显示，高盐处理之后，转基因苜蓿和未Ａ）Ｂ）；转基因苜蓿的差异不大，干旱处理之后，转基因苜蓿中的相对含水量要高于未转基因苜蓿（图６丙二醛含量均Ｃ）；有显著的增加，转基因苜蓿的增幅小于未转基因苜蓿，干旱处理之后丙二醛的增加量大于高盐处理（图６在转Ｄ）基因和未转基因苜蓿中脯氨酸的含量均大幅增加，转基因苜蓿的增幅大于未转基因苜蓿，高盐处理之后的增幅大。于干旱处理（图６Ｅ）３　讨论

，碱性亮氨酸拉链（蛋白是真核生物的转录因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的类ｂａｓｉｃｌｅｕｃｉｎｅｚｉｅｒｂＺＩＰ）　　ｐｐ

五星文库wxphp.com包含总结汇报、外语学习、党团工作、行业论文、人文社科、旅游景点、出国留学、文档下载、IT计算机以及紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测_李燕_图文等内容。

本文共2页12

  本文关键词：紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测，由笔耕文化传播整理发布。