AcMNPV中LEF-10过量表达与聚集对病毒晚期基因表达的影响

发布时间：2017-09-14 17:00

  本文关键词：AcMNPV中LEF-10过量表达与聚集对病毒晚期基因表达的影响

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【摘要】：lef-10基因作为苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的必需基因,其主要参与了病毒DNA的复制和晚期基因表达,属于晚期表达因子。在之前的研究中发现,LEF-10在大肠杆菌中能够形成高分子量的复合体并且这种复合体的存在是极其稳定的,而我们在Sf9细胞中也同样观察到了LEF-10在细胞质中形成的聚集体,这种聚集体对病毒的复制以及晚期基因的表达产生的影响,将是本实验研究的重点。本实验以p10启动子控制的mCherry作为报告基因,对宿主细胞中LEF-10的表达和分布情况以及mCherry的表达水平进行分析。实验发现当LEF-10均匀分布于细胞核中时,能够正常发挥其功能,使得极晚期基因正常表达,一旦LEF-10在细胞质中发生聚集,其不能进入到细胞核中,导致宿主细胞核中的LEF-10减少,不足以支撑某些晚期基因与极晚期基因的转录活动,从而使得极晚期启动子p10启动的mCherry表达量下降。我们根据这一结论,建立了LEF-10聚集对基因表达影响的模型。同时,我们发现LEF-101-65在自身启动子下表达量要稍低于野生型,它只能恢复全长LEF-10的部分功能。而为了进一步确定LEF-10的过量表达对LEF-10的聚集以及晚期基因表达的影响,我们根据截短型LEF-101-65的功能与野生型LEF-10相当,但不易在细胞中发生聚集的特点,分别构建了p10启动子下LEF-10和LEF-101-65过量表达的重组杆状病毒,在感染Sf9细胞后,对宿主细胞中LEF-10以及LEF-101-65的表达情况进行了分析并检测了某些晚期基因的表达水平,由于LEF-101-65在自身启动子下表达量要稍低于野生型,它只能恢复全长LEF-10的部分功能,发现由p10启动子启动的LEF-10的表达量要明显低于LEF-101-65的表达量,表明LEF-10的过量表达会导致极晚期基因p10的表达量下降。我们认为在LEF-10过量表达时,大量LEF-10在细胞质中发生聚集,病毒晚期基因以及极晚期基因的表达水平降低;而在LEF-101-65过量表达的宿主细胞中,则不会发生LEF-101-65的大量聚集,使得晚期基因以及极晚期基因的表达不受影响。为了验证这一观点,我们选取了五种晚期表达基因pp78/83,vp39,sod,odv-e56,vp-80并检测了其表达水平,进一步证实了上述观点。本实验通过构建LEF-10正常表达以及过量表达的重组病毒,验证了LEF-10在Sf9细胞中的聚集对晚期基因表达的影响,并由此构建了LEF-10的聚集与其功能的关系模型,为进一步研究LEF-10的功能奠定了基础,也为其他能形成复合物的蛋白的研究提供了新途径。
【关键词】：苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV) LEF-10 蛋白质聚集 晚期基因表达 草地贪夜蛾卵巢细胞系(Sf9)
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q786
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1.1 杆状病毒概述11-15
• 1.1.1 杆状病毒的起源及分类11-12
• 1.1.2 杆状病毒的形态特征及感染周期12-14
• 1.1.3 苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒14-15
• 1.2 杆状病毒晚期表达因子15-18
• 1.2.1 晚期表达因子15-16
• 1.2.2 其它lef基因介绍16-18
• 1.3 蛋白表达系统18-19
• 1.4 实验目的、意义及立项依据19-21
• 第二章 Lef-10聚集的分布及影响21-31
• 2.1 材料与试剂21-22
• 2.1.1 菌株与质粒21
• 2.1.2 生化试剂21
• 2.1.3 主要溶液配方21-22
• 2.1.4 主要仪器22
• 2.1.5 引物设计与合成22
• 2.2 实验方法22-26
• 2.2.1 野生型pTriEx- plef-10_lef10GFP-pp10_mCherry质粒构建22-24
• 2.2.2 截短型pTriEx- plef-10_lef10165-GFP-pp10_mC herry质粒构建24-25
• 2.2.3 包装重组杆状病毒25
• 2.2.4 极限稀释法测定病毒滴度25-26
• 2.2.5 重组型杆状病毒感染Sf9细胞26
• 2.2.6 荧光显微镜观察LEF-10在Sf9细胞中的状态26
• 2.2.7 流式细胞实验26
• 2.3 结果与分析26-31
• 2.3.1 重组质粒pTriEx- plef-10_lef10GFP-pp10_mCherry的克隆26-27
• 2.3.2 截短型pTriEx- plef-10_lef10165-GFP-pp10_mC herry质粒的克隆27-28
• 2.3.3 LEF-10聚集导致其功能下调28-29
• 2.3.4 LEF-10羧基端截短对p10表达的影响29-31
• 第三章 hsp70启动子启动LEF-10过量表达31-41
• 3.1 材料与试剂31-32
• 3.1.1 菌株与质粒31
• 3.1.2 生化试剂31
• 3.1.3 主要溶液配方31
• 3.1.4 主要仪器31
• 3.1.5 引物设计与合成31-32
• 3.2 实验方法32-36
• 3.2.1 野生型及截短型LEF-10过量表达质粒构建32-33
• 3.2.2 热启动LEF-10过量表达质粒构建33-35
• 3.2.3 包装重组杆状病毒35
• 3.2.4 热启动Hsp70过表达lef-1035-36
• 3.2.5 倒置荧光显微镜观察荧光表达36
• 3.2.6 流式细胞实验36
• 3.3 结果与分析36-41
• 3.3.1 野生型及截短型LEF-10过量表达质粒的克隆36-37
• 3.3.2 热启动LEF-10过量表达质粒的克隆37-38
• 3.3.3 热启动LEF-10过量表达荧光结果38-40
• 3.3.4 lef-10过量表达流式细胞结果40-41
• 第四章 LEF-10聚集对晚期基因表达水平影响41-46
• 4.1 材料与试剂41-42
• 4.1.1 重组病毒41
• 4.1.2 生化试剂41
• 4.1.3 主要溶液配方41
• 4.1.4 主要仪器41
• 4.1.5 引物设计与合成41-42
• 4.2 实验方法42-43
• 4.2.1 极限稀释法测定病毒滴度42
• 4.2.2 重组型杆状病毒感染Sf9细胞42
• 4.2.3 流式细胞实验42
• 4.2.4 Sf9细胞RNA提取42-43
• 4.2.5 DNA酶处理及反转录43
• 4.2.6 半定量PCR检测病毒晚期基因表达43
• 4.3 结果与分析43-46
• 4.3.1 LEF-10羧基末端截短影响LEF-10过量表达43-44
• 4.3.2 Sf9细胞RNA提取结果44-45
• 4.3.3 LEF-10羧基末端截短对晚期基因表达的影响45-46
• 第五章 讨论46-49
• 第六章 结论49-50
• 参考文献50-56
• 缩略词56-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

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本文编号：851196