禾谷镰刀菌FgCHS8基因功能研究

发布时间：2017-09-15 13:41

  本文关键词：禾谷镰刀菌FgCHS8基因功能研究

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【摘要】：赤霉病降低产量劣化品质,是小麦的主要病害之一。禾谷镰刀菌是引起赤霉病的主要致病菌。科学认识禾谷镰刀菌的致病机理,对高效防治赤霉病非常重要。几丁质是丝状真菌细胞壁的重要组成成分,在生长和生殖中起重要作用。几丁质合成酶是几丁质生物合成途径重要限速酶。水杨酸(SA)是一种重要的植物抗性激素,与小麦赤霉病抗性密切相关。本文对一个受SA抑制的几丁质合成酶基因(CHS)FGSG_06550进行功能分析,取得以下主要结果：1、从Ensemb1 Fungi数据库中获取FGSG_06550基因序列和蛋白序列；对分属于18种真菌的89个几丁质合成酶基因进行系统进化树分析和结构域分析,发现几丁质合成酶基因家族可被分为3大类,8个小类,FGSG_06550属于第2大类,第8小类,因此将其命名为FgCHS8;结构域预测同时发现其氨基酸序列含有特定的催化结构域C2(Chitin_synth_2,Pfam03142)和细胞色素b5结构域(cytochrome b5-like domain,Pfam00173)。2、构建FgCHS8基因的敲除突变体(△FgCHS8)和回复突变体(C-FgCHS8),发现野生型(WT)、△FgCHS8和C-FgCHS8分生孢子的长、宽和隔膜数差异不显著。检测WT、△FgCHS8和C-FgCHS8在酸、盐、氧化剂和SA胁迫条件下的生长状况,发现△FgCHS8突变体对胁迫的敏感性增加。3、构建FgCHS8与GFP的融合蛋白,在荧光显微镜下观察,发现FgCHS8蛋白位于隔膜和成熟菌丝的细胞膜,说明FgCHS8蛋白主要在禾谷镰刀菌的隔膜和细胞膜发挥作用。4、对接种于1 mM刚果红的WT、△FgCHS8和C-FgCHS8突变体菌丝培养基剖面进行观察时,发现相比于WT和C-FgCHS8突变体,△FgCHS8刚果红颜色明显变浅。测定几丁质和几丁质合成酶含量发现,△FgCHS8几丁质合成酶和几丁质含量比WT和C-FgCHS8突变体均显著减少,这说明FgCHS8编码几丁质合成酶,参与几丁质代谢。5、接种小麦,测定单端孢霉烯(Deoxynivalenol;DON)含量发现,相比WT和C-FgCHS8,△FgCHS8接种麦穗发病面积、扩散速率和DON积累明显受抑制,证明FgCHS8基因对禾谷镰刀菌致病力和DON的合成具有重要影响。
【关键词】：赤霉病 水杨酸 几丁质 几丁质合成酶 致病性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.121.45
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 研究背景9-15
• 1.1 小麦赤霉病的危害9
• 1.2 赤霉病病原菌及特征9-10
• 1.3 禾谷镰刀菌生活史10-11
• 1.4 禾谷镰刀菌功能基因研究现状11-12
• 1.5 几丁质合成酶基因研究12-15
• 第二章 实验材料及方法15-23
• 2.1 供试材料15
• 2.2 供试载体15
• 2.3 培养基配制15-16
• 2.4 生化试剂16
• 2.5 实验仪器16
• 2.6 序列分析16-17
• 2.7 敲除和回复突变体载体构建17-19
• 2.8 冻融法转化农杆菌19
• 2.9 禾谷镰刀菌和农杆菌的共培养19
• 2.10 突变体的潮霉素B筛选和分离纯化19-20
• 2.11 敲除和回复突变体的分子鉴定20-21
• 2.11.1 PCR检测突变体20
• 2.11.2 RT-PCR检测20-21
• 2.11.3 qPCR检测21
• 2.12 表型鉴定和亚细胞定位21
• 2.13 几丁质含量测定21-22
• 2.14 几丁质合成酶含量测定22
• 2.15 致病力和DON毒素测定22-23
• 第三章 实验结果与分析23-34
• 3.1 序列分析23-24
• 3.2 T-DNA载体的构建24-27
• 3.3 △FgCHS8和C-FgCHS8突变体的筛选和鉴定27-28
• 3.4 FgCHS8基因对分生孢子的影响28
• 3.5 FgCHS8基因对细胞壁敏感性的影响28-30
• 3.6 FgCHS8基因亚细胞定位30
• 3.7 FgCHS8基因对几丁质产量的影响30-32
• 3.8 FgCHS8基因对禾谷镰刀菌致病力的影响32-34
• 第四章 讨论34-36
• 参考文献36-43
• 附表43-46
• 致谢46-47
• 硕士期间论文发表47

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本文编号：856873