Tol2转座子介导的斑马鱼基因诱变、筛选及斑马鱼胚盾特异表达基因的鉴定

发布时间：2017-09-17 05:14

  本文关键词：Tol2转座子介导的斑马鱼基因诱变、筛选及斑马鱼胚盾特异表达基因的鉴定

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【摘要】：斑马鱼是一种优良的模式动物,其胚胎发育过程受到很多基因和信号通路的参与和调控,非常适合用来做发育生物学方面的研究以及疾病遗传模型构建等。突变体作为一种基因功能缺失,是研究基因功能和揭示发育机制的重要工具。为深入探究斑马鱼胚胎的发育过程、了解其中的发育机制,并寻找更多斑马鱼发育的研究素料,本论文研究通过Tol2转座子介导的基因捕获技术获得绿色荧光蛋白(GFP)基因特异性表达的转基因鱼品系。进一步筛选到斑马鱼胚胎发育相关的突变体,鉴定出发生突变的相关基因,并对其在胚胎发育过程中作用和功能做了初步分析。本次实验通过对斑马鱼单细胞显微注射Tol2质粒和mRNA,共捕获到6种特异表达GFP的转基因鱼品系,我们对其中2种荧光出现较早的品系进行了MZ(母源合子)纯合体筛选,发现其一种突变体在母源纯合体时有外包缺陷,另一种纯合体虽然没有观察到与该基因一致的表型,但是该品系荧光在神经系统特异表达,可以作为研究神经系统发育的有力工具,并且在其中一条F2代雌鱼的子代中观察到脊椎发育缺陷。Tol2：20141017m品系的荧光分布具有一定的时空特异性,该品系转基因鱼的荧光在母源和合子期都有表达,在胚盾时期表达在边缘区域,体节期间主要表达在脊索和体节,受精后24 h表达在生肌节和卵黄合胞体。利用TAIL-PCR分析,鉴定到所捕获的基因为si:ch73-52f24.4.根据与Ensembl中数据比对发现si:ch73-52f24.4有三个转录本,但都不能编码蛋白。Tol2转座子插入到si:ch73-52f24.4的前两个转录本的第一个内含子中,因转座子中自带了尾巴结构,阻断了这两个转录本的正常表达,而第三个转录本从位置上看不受到影响。该转基因突变体的母源纯合体胚胎在外包过程中有明显的缺陷：外包过程时间延长、卵黄无法被完全吸收,尾芽变得扁平,一部分胚胎甚至无法发育到体节期,而能够正常发育到24 h的胚胎的身体长度较野生型短。所以我们初步分析si:ch73-52f24.4是一种重要的影响外包过程的母源的长链非编码RNA,它可能对于胚层的分化以及体节的发育都有很重要的影响。Tol2:20141221t品系的荧光在神经系统中特异表达,表达部位主要集中在脑部和脊椎上侧,使用TAIL-PCR和5'RACE鉴定发现所捕获的基因为satl.a。它是一种亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(spermidine/spermine Nl-acetyltransferase),在斑马鱼中有三种同源基因。Tol2转座子插入到第8个内含子中,致使sat1.a基因转录提前终止。目前在F2代纯合体没有观察到与该基因一致的发育缺陷,但同时也发现4条雌鱼中有一条产生的后代脊椎全都是弯曲的。然而这种突变类型与荧光所在位置并不一致,目前我们还没有弄清楚是否与该基因有关,如果无关,又是什么基因发生了突变。综上论述,Tol2转座子介导的基因捕获技术作为正向遗传学研究工具的可行性,本课题成功地捕获到一种lncRNA,这是以前没有人报道过的,为我们研究lncRNA提供了一种新素材；另外在神经系统表达的品系可以作为一种非常好的神经系统荧光标记,可以为我们研究斑马鱼的神经系统发育提供参考。另外,作者还参与了斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定得工作：通过从Tg(gsc:GFP)转基因鱼胚胎中分离富集GFP阳性细胞,RNA深度测序最后确认了isthminl,KIAA1324, rrbp1b,ripply1,twist2,nme4,zgc174153等7个基因在胚盾特异表达,为下一步研究这些基因的发育生物学功能研究奠定了基础。
【关键词】：斑马鱼 Tol2基因捕获 si:ch73-52f24.4 lncRNA sat1.a 胚盾
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-21
• 1.1 斑马鱼及早期胚胎发育11-12
• 1.2 斑马鱼的基因操作和Tol2转座子12-16
• 1.2.1 斑马鱼的基因操作12-13
• 1.2.2 转座子和Tol2转座子13-16
• 1.3 胚盾特异表达的基因16-18
• 1.4 本课题研究的目的、内容和意义18-21
• 第二章 材料和方法21-35
• 2.1 斑马鱼品系和培养21
• 2.2 质粒和转座酶mRNA合成21-22
• 2.3 显微注射和胚胎筛选22-23
• 2.3.1 胚胎准备22
• 2.3.2 单细胞显微注射22-23
• 2.3.3 胚胎培养和突变体品系筛选23
• 2.4 质粒大提、基因组和总RNA提取23-26
• 2.4.1 质粒大提23-24
• 2.4.2 基因组提取24-25
• 2.4.3 简易基因组提取25
• 2.4.4 胚胎总RNA提取25-26
• 2.5 TAI1-PCR和5'RLM-RACE26-30
• 2.5.1 热不对称交错PCR(TAIL-PCR)26-28
• 2.5.2 5' RLM-RACE28-30
• 2.6 探针RNA合成和原位杂交30-32
• 2.6.2 整胚原位杂交30-32
• 2.7 GFP阳性细胞的分离富集32
• 2.8 流式细胞仪操作(Flow cytometry)32-33
• 2.9 荧光实时定量PCR和半定量RT-PCR33-35
• 2.9.1 荧光实时定量PCR33
• 2.9.2 半定量RT-PCR(Semi-quantitative Reverse Transcription PCR)33-35
• 第三章 结果35-53
• 3.1 Tol2：20141017m品系和si：ch73-52f24.435-41
• 3.1.1 检测Tol2：20141017m GFP在不同发育时期的表达图式35-36
• 3.1.2 Tol2：20141017m品系母源表达的不完全性36-37
• 3.1.3 基因连锁分析si：ch73-52f24.4和Tol2转座子之间是连锁的37-38
• 3.1.4 TAIL-PCR鉴定到基因所在位置38-39
• 3.1.5 原位杂交证明确实为该基因39
• 3.1.6 表型分析发现该品系在外包过程中有缺陷39-41
• 3.2 Tol2：20141221t品系和sat1.a41-47
• 3.2.1 检测Tol2：20141221t品系胚胎中GFP在不同发育时期的表达图式41-42
• 3.2.2 鉴定到Tol2：20141221t品系中Tol2转座子捕获的基因为sat1.a42-43
• 3.2.3 sat1.a基因具有与Tol2：20141221t品系GFP相似的表达图式43-45
• 3.2.4 sat1.a突变体没有明显的发育缺陷45-46
• 3.2.5 发现与预期不相符的表型46-47
• 3.3 斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定47-53
• 3.3.1 Tg(gsc：GFP)转基因斑马鱼胚胎适合于分离富集胚盾中胚层细胞47-48
• 3.3.2 流式细胞分选获得高纯度的GFP阳性细胞48-49
• 3.3.3 系统鉴定胚盾高表达基因49-51
• 3.3.4 原位杂交确定胚盾特异表达的基因51-53
• 第四章 结论和讨论53-57
• 4.1 捕获到一个lncRNA53
• 4.2 sat1.a可以作为一个神经系统分子标记53-54
• 4.3 突变体中GFP的翻译并不一定依赖插入基因的启动密码子54
• 4.4 Tol2介导的基因捕获技术一个非常好的正向遗传学研究工具54
• 4.5 我们鉴定到胚盾高表达基因54-57
• 参考文献57-63
• 附录63-69
• 测序结果63-65
• Tol2：20141017m品系TAIL-PCR测序结果(T3-3)63
• Tol2：20141017m品系cDNA鉴定测序结果(连接载体PUC19测序引物M13F)63-64
• Tol2：20141221t品系TAIL-PCR测序结果(引物T3-3)64
• Tol2：20141221t品系5'RACE测序结果(引物eGFP1)64-65
• 试剂配制65-69
• 质粒大提试剂65
• 基因组提取试剂65
• 原位杂交所需溶液的配制65-67
• 流式细胞所需溶液配制67-69
• 发表文章与获奖情况69-71
• 发表文章69
• 获奖情况69-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孙智慧;孟安明;;斑马鱼胚胎中受Nodal信号调控基因的鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2007年06期

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本文编号：867457