喜盐鸢尾转录组分析及花青素合成关键基因克隆与表达分析

发布时间：2017-09-18 10:23

  本文关键词：喜盐鸢尾转录组分析及花青素合成关键基因克隆与表达分析

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【摘要】：喜盐鸢尾(Iris halophila)具有耐盐耐旱特性,是一种很有发展潜力的耐盐园林绿化植物。喜盐鸢尾的花为黄白色,而它的另一个形态特征高度一致的分类学变种——蓝花喜盐鸢尾(I. halophila var. sogdiana)的花色为蓝色或紫色。从分子遗传学角度,喜盐鸢尾是蓝花喜盐鸢尾的花青素生物合成的天然突变体,因此,喜盐鸢尾是一种研究花青素生物合成的理想材料。本研究利用这两种植物花蕾的内轮花被为材料,进行了不同花色的组织特异性转录组比较分析,克隆了喜盐鸢尾花青素生物合成相关的差异表达基因片段,包括编码查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)和类黄酮-3',5'-羟化酶类(F3'5'H-like)的基因,旨在阐明喜盐鸢尾花青素生物合成机理与花被着色机理,并为蓝花基因工程改造积累基因资源。在本研究中,分别利用两种植物未开放的花蕾,剥取其内轮花被提取其总RNA,利用Illumina第二代测序技术进行了高通量测序。测序片段利用NCBI NR蛋白质数据库和Swiss-prot蛋白质数据库进行了序列注释,并通过RPKM值判断转录本丰度相对差异。共从转录组中组装获得171173条转录本并map到35,543条Unigenes,转录本平均长度为479bp,Unigene平均长度750bp。对actin、tubulin、ubiquitin、磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油醛脱氢酶(GPDH)、真核细胞翻译起始因子等多个持家基因的表达分析表明,两种植物材料的基础转录水平相近。74个Unigenes分属于12个基因类型的花青素生物合成相关基因。根据两个转录组相应转录本的RPKM之比,初步确定了6个RPKM比大于10的差异表达基因,其中F3'5'H-like转录本RPKM比值高达155.17。根据转录组测序组装结果设计了相应基因的特异引物,通过逆转录PCR(RT-PCR)克隆获得了花青素生物合成相关的关键基因片段。克隆片段通过BLASTX搜索蛋白质数据库以寻找同源基因并确定正确的读码框,利用Mega软件进行了系统发生树分析。克隆的基因片段以TUBULIN为内参基因分别在喜盐鸢尾与蓝花喜盐鸢尾中进行了实时定量PCR表达分析。基因克隆结果表明,在喜盐鸢尾中分别克隆了CHS基因的326bp片段和420bp片段、CHI基因的461bp片段和F3'5'H-like基因的496bp片段；从蓝花喜盐鸢尾中克隆了CHS基因的311bp片段、CHI基因的457bp片段和F3'5'H-like基因的498bp片段。实时定量PCR结果显示CHS与F3'5'H-like基因在蓝花喜盐鸢尾中高水平表达,分别是在喜盐鸢尾中的5.27倍与3.71倍。序列分析结果表明,在蓝花喜盐鸢尾所获得的F3'5'H-like与经典的属于细胞色素P450 CYP75A亚家族的F3'5'H不同,而与万代兰的F3'5'H-like同属于CYP76AB亚家族,为一类新的蓝花相关基因。比较转录组分析结果显不F3'5'H-like在蓝花喜盐鸢尾中高水平表达,与实时定量PCR验证结果致,可能是两种植物花色显著差异的主要原因。
【关键词】：喜盐鸢尾 蓝花喜盐鸢尾 转录组分析 花青素合成 类黄酮-3' 5'-羟化酶类
【学位授予单位】：中央民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S682.19
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 缩略词8-12
• 第一章 前言与综述12-20
• 1.1 喜盐鸢尾概述12-13
• 1.2 花青素与花色13-14
• 1.3 蓝色花基因工程14-15
• 1.4 鸢尾属植物花色遗传改良研究背景15-16
• 1.5 转录组测序(RNA-Seq)的原理与应用16-18
• 1.6 科学问题的提出及技术路线18-20
• 第二章 转录组文库的构建及花青素合成关键基因的筛选20-50
• 2.1 材料与方法20-23
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 主要试验仪器20
• 2.1.3 RNA样品的制备20-21
• 2.1.4 RNA样品的检测21
• 2.1.5 反转录21
• 2.1.6 转录组测序21
• 2.1.7 差异基因和关键基因的选取及转录组部分结果的验证21-23
• 2.2 结果与分析23-45
• 2.2.1 RNA提取及质量检测23-24
• 2.2.2 测序结果概要24-27
• 2.2.3 Unigene聚类及功能注释27-32
• 2.2.4 Unigene的表达量分析32-42
• 2.2.5 花青素合成差异基因及关键基因的选取结果42-45
• 2.2.6 转录组部分结果的验证45
• 2.3 讨论45-50
• 2.3.1 关于喜盐鸢尾转录组测序分析45-46
• 2.3.2 数据组装效率分析46-47
• 2.3.3 RNA-seq在不同植物群体间比较转录组结果的有效性47
• 2.3.4 喜盐鸢尾花青素生物合成差异表达基因47-48
• 2.3.5 喜盐鸢尾花青素生物合成途径与表达调控分析48-50
• 第三章 喜盐鸢尾与蓝花喜盐鸢尾花青素合成差异基因及关键基因的克隆及表达分析50-66
• 3.1 材料与方法50-53
• 3.1.1 试验材料及主要试验仪器50
• 3.1.2 差异基因与关键基因克隆及表达分析50-53
• 3.2 结果与分析53-61
• 3.2.1 花青素合成差异基因及关键基因的克隆及序列分析53-60
• 3.2.2 花青素合成差异基因及关键基因的表达分析60-61
• 3.3 讨论61-66
• 3.3.1 喜盐鸢尾F3’5’H-like是不同于典型F3’5’H的新蓝花基因62-63
• 3.3.2 从喜盐鸢尾克隆CHS、CHI、LDOX等基因的特点63-64
• 3.3.3 F3’5'H-like与CHS的差异表达导致花色差异64
• 3.3.4 假基因可能导致花色差异64-66
• 第四章 全文结论及研究展望66-68
• 参考文献68-73
• 致谢73-74
• 攻读学位期间参与的科研项目74
• 攻读学位期间发表的学术论文74

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本文编号：874954