用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向关系

发布时间：2017-09-19 00:40

  本文关键词：用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向关系

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【摘要】：目的:构建长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)萤光素酶报告质粒,利用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的靶向关系。方法:通过生物信息学网站RegRNA2.0预测获取小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p潜在的互补结合位点。将H19及其突变体克隆到萤光素酶载体psi CHECK-2中,构建H19野生型和突变型质粒,并采用酶切和测序方法鉴定psi CHECK-2-H19载体是否构建成功。将H19野生型和突变型质粒分别与miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照或miR-199a-5p抑制剂阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性,从而对lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向调节关系进行验证。结果:构建的重组萤光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确,双萤光素酶报告基因检测显示,与miR-199a-5p模拟物阴性对照组相比,miR-199a-5p模拟物组H19野生型报告基因的萤光素酶活性显著降低,下降约49%左右(P0.01),而miR-199a-5p抑制剂组H19野生型报告基因的萤光素酶活性较miR-199a-5p模拟物组明显增高(P0.01)。miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照以及miR-199a-5p抑制剂阴性对照对H19突变型的萤光素酶活性均无明显影响。结论:lncRNA-H19能够靶向结合miR-199a-5p,并在转录后水平对其有直接抑制作用。
【作者单位】： 中山大学孙逸仙纪念医院急诊科;中山大学孙逸仙纪念医院心内科;
【关键词】： 长链非编码RNA-H 微小RNA-a-p 双萤光素酶报告基因
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No.81270213;No.81070125;No.81670306) 广东省科技计划(No.2010B031600032;No.2014A020211002) 高校基本科研业务费中山大学青年教师重点培育项目(No.13ykzd16) 广东省医学科研基金资助项目(No.A2016264)
【分类号】：R3416
【正文快照】： 非编码RNA在蛋白表达中具有重要调控作用。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子,其能够从不同层面实现对基因表达的调控作用[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸分子的内源性非编码RNA,通过与靶基因3’端

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本文编号：878512