耐旱耐盐抗除草剂转基因棉花新材料的鉴定

发布时间：2017-09-19 08:07

  本文关键词：耐旱耐盐抗除草剂转基因棉花新材料的鉴定

  更多相关文章： 转基因棉花 农杆菌介导 转录因子 耐旱性 耐盐性

【摘要】：棉花属于重要的经济作物,但是受土壤干旱和盐碱化面积日益加大的影响,棉花的产量和品质明显下降,给生产和经济带来巨大损失。随着生物技术的不断发展,运用基因工程方法创制耐旱耐盐碱棉花新材料、新种质,是目前棉花领域应用最广泛,最有效的育种途径。ERF(Ethylene responsive factor)类转录因子是植物特有的类蛋白质分子,普遍参与调控植物对外界各种胁迫的应答反应。为了提高棉花对干旱和盐碱的耐受能力,本研究利用农杆菌介导法,将分别从抗旱沙生植物胡杨(Populus euphratica Oliv.)和海水潮汐带红树林植物秋(Kandelia candel (Linn.) Druce)中分离的PeDREB2a和KcERF转录因子基因构建在含CP4抗性标记基因的表达载体上并转化棉花,对转基因棉花进行鉴定与分析,获得了一定数量的转基因棉花株系,为棉花抗逆性的研究提供了一定的实验材料。主要结果如下：(1)通过转化拟南芥,从已构建好的5个表达载体中筛选出表达性状最佳、以rd29A为启动子的双价载体：pCAMBIAl302-KcERF-PeDREB2a,利用农杆菌介导法将其导入陆地常规棉R15,经培养基培育、嫁接、定植、温室培养、PCR分子检测,最终获得32株转基因棉花。(2)转基因棉花通过冬季海南加代、夏季河北继代,最终获得T3代转基因棉花株系。(3)对常规棉花R15进行不同浓度的Kanamycin(Kan)喷施处理,初步确定基其Kan抗性筛选浓度为1500 mg/L,待T3代转基因棉花长至4～5片真叶时,进行Kan喷施,初筛抗性棉株,剔除非抗性棉株。(4)对T3代初筛抗性棉株进行PCR、反转录PCR分子检测,获得6株转基因棉花,通过Southern杂交分析得出,外源基因多以单拷贝的方式插入受体细胞基因组中,转基因植株的遗传遵循孟德尔遗传定律,而且,子代无基因沉默现象。(5)对大田T3代转基因棉花、以及对照组常规棉R15进行草甘膦喷施处理,转基因棉花表现出良好的除草剂抗性,而对照组几乎全部死亡,证明抗除草剂基因CP4-epsps专入棉花体内并进行了表达。(6)室内种植部分转基因棉花株系,对其进行15%PEG6000 和 200mmol/LNaCl处理,观察表型变化,同时通过干旱和盐胁迫下相关生理指标的分析得出,干旱和高盐胁迫下,转基因棉花的长势明显优与对照组,转KcERF-PeDREB基因棉花体内的MDA含量显著低于对照组,C AT、SOD活性和游离脯氨酸含量均高于对照组,同时,与对照组相比,转基因棉花的根系更发达,种子饱满度更高。通过qPCR分析胁迫后棉株KcERF和PeDREB2a基因表达量,发现干旱和盐胁迫均可诱导外源PeDREB、KcERF基因超表达。综上,PeDREB、KcERF基因提高了棉花的耐旱、耐盐能力。
【关键词】：转基因棉花 农杆菌介导 转录因子 耐旱性 耐盐性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S562
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 文献综述10-21
• 1.1 棉花概述10
• 1.2 棉花耐旱、耐盐研究进展10-16
• 1.2.1 干旱对植物的影响及胁迫响应机制10-11
• 1.2.2 盐碱对植物的影响及胁迫响应机制11-12
• 1.2.3 提高植物耐旱耐盐的途径12-13
• 1.2.4 棉花耐旱、耐盐研究进展13-16
• 1.3 抗除草剂棉花研究进展16-17
• 1.4 植物抗逆转录因子概述17-19
• 1.4.1 转录因子的功能17
• 1.4.2 抗逆转录因子分类及特点17-18
• 1.4.3 ERF/DEEB概述18-19
• 1.5 棉花转基因育种方法19-20
• 1.5.1 农杆菌介导法19
• 1.5.2 花粉管通道法19
• 1.5.3 基因枪法19-20
• 1.6 研究目的和意义20-21
• 第二章 农杆菌介导法获得转基因棉花21-38
• 2.1 实验材料21-26
• 2.1.1 棉花材料21
• 2.1.2 基因来源21
• 2.1.3 引物序列21-22
• 2.1.4 载体和菌种22-23
• 2.1.5 培养基23-25
• 2.1.6 相关试剂及缓冲液25
• 2.1.7 仪器和设备25-26
• 2.2 实验方法26-30
• 2.2.1 携带中间载体的大肠杆菌活化及鉴定26
• 2.2.2 农杆菌感受态制备26-27
• 2.2.3 农杆菌转化27
• 2.2.4 含目的基因表达载体鉴定27
• 2.2.5 最优表达载体的筛选27-28
• 2.2.6 遗传转化28-29
• 2.2.7 阳性棉株鉴定29
• 2.2.8 转化幼苗的定植29-30
• 2.2.9 T1代转基因棉花的获得30
• 2.3 结果及分析30-36
• 2.3.1 农杆菌转化及鉴定30-31
• 2.3.2 最优表达载体的筛选31-32
• 2.3.3 农杆菌介导的棉花遗传转化32-34
• 2.3.4 转基因阳性幼苗的鉴定34-35
• 2.3.5 转化幼苗的定植35-36
• 2.4 讨论36-38
• 第三章 转基因棉花的鉴定及抗性分析38-54
• 3.1 实验材料38-39
• 3.1.1 棉花材料38
• 3.1.2 基因来源38
• 3.1.3 引物序列38-39
• 3.1.4 相关试剂及缓冲液39
• 3.2 实验方法39-43
• 3.2.1 T3代转基因棉花的获得39-40
• 3.2.2 转基因棉花的抗性筛选40-43
• 3.3 结果与分析43-51
• 3.3.1 卡那霉素筛选浓度的确定及转基因棉花大田筛选43-44
• 3.3.2 反转录PCR检测目的基因表达情况44-45
• 3.3.3 Southern blot结果分析45
• 3.3.4 转基因棉花的田间农艺性状分析45-46
• 3.3.5 大田喷施除草剂进行抗性鉴定46
• 3.3.6 转基因棉花的耐受性分析46-51
• 3.4 讨论51-54
• 结论54-55
• 参考文献55-62
• 致谢62-63
• 攻读学位期间发表的学术论文63

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本文编号：880474