甜瓜乙烯应答因子基因CmERFI-5、CmERFI-13、CmERFI-15在果实发育过程中的功能分析

发布时间：2017-09-20 03:10

  本文关键词：甜瓜乙烯应答因子基因CmERFI-5、CmERFI-13、CmERFI-15在果实发育过程中的功能分析

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【摘要】：本文以甜瓜品种河套蜜瓜为材料,研究了甜瓜乙烯应答因子(Ethylene response factor, ERF)基因CmERFI-5、CmERFI-13、 CmERFI-15在果实中的功能。ERF基因位于乙烯信号转导途径的下游,通过结合GCC-box调控下游靶基因的表达,从而起到调控果实发育的功能。采用RT-PCR技术从甜瓜中克隆到了CmERFI-5、 CmERFI-13(?)CmERFI-15基因的cDNA。所克隆的全长cDNA分别为934 bp、879 bp和769 bp,其ORF分别为732 bp、834 bp、636 bp,编码243、277、211个氨基酸。分别构建其超表达载体和RNAi载体,通过农杆菌介导的瞬时表达技术将目的基因的超表达及RNAi载体注射到绿熟期甜瓜果实中,并对注射部位进行观察。CmERFI-5基因的超表达和RNAi干扰载体使注射部位均出现了保持绿色(延迟成熟)的表型。CmERFI-13基因的超表达载体注射部位提前变黄,而RNAi干扰质粒使注射部位保持绿色。CmERFI-15基因的超表’达载体注射部位保持绿色,而RN Ai载体注射部位提前变黄。分子检测结果显示,注射CmERFI-5、CmERF1-13和CmERFI-15基因的超表达载体后,注射部位与对照相比目的基因的表达量上升,表明外源基因得到了表达；注射RNAi载体后,目的基因的表达量与对照相比下降,表明成功抑制了内源基因的表达。果实成熟相关基因的qRT-PCR检测表明,CmERFI-5基因没有显示出调控作用,CmERFI-13基因对CmACO1、 CmACS1、CmADH2和CmCCDl基因有正调控作用。CmERFI-15基因对CmACO1、CmACSl基因有负调控的作用。综上所述,在果实成熟过程中CmERFI-5基因没有功能,CmERFI-13基因具有促进果实成熟的功能,而CmERFI-15具有延缓果实成熟的功能。
【关键词】：甜瓜 ERF 转录因子 瞬时表达
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S652
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 引言11-23
• 1.1 甜瓜11-12
• 1.2 甜瓜果实发育的分子机理12-14
• 1.2.1 激素对果实发育的影响12
• 1.2.2 果实发育过程中的主要水解酶12-13
• 1.2.3 影响果皮颜色的主要色素13
• 1.2.4 果实发育中的蔗糖代谢13
• 1.2.5 芳香物质产生的相关分子机理13-14
• 1.3 植物转录因子研究进展14-18
• 1.3.1 转录因子的结构14-15
• 1.3.2 植物转录因子的分类15-16
• 1.3.3 植物转录因子的研究方法16-18
• 1.4 乙烯信号通路研究概况18-20
• 1.4.1 乙烯受体18-19
• 1.4.2 CTR119
• 1.4.3 EIN219-20
• 1.4.4 EIN3/EILS20
• 1.4.5 ERF20
• 1.5 果实中ERF转录因子的研究进展20-22
• 1.6 本研究的目的和意义22-23
• 2 材料与方法23-34
• 2.1 研究材料23-26
• 2.1.1 材料田间种植23
• 2.1.2 材料、菌种及主要试剂23-24
• 2.1.3 引物合成24-26
• 2.2 研究方法26-34
• 2.2.1 cDNA克隆26-27
• 2.2.2 超表达载体的构建27-29
• 2.2.3 RNAi载体构建29-32
• 2.2.4 甜瓜果实瞬时表达32-34
• 3 结果与分析34-58
• 3.1 CmERFI-5、CmERFI-13,CmERFI-15基因的克隆34-40
• 3.1.1 RT-PCR扩增cDNA产物分析34-35
• 3.1.2 重组子筛选35-38
• 3.1.3 序列分析38-40
• 3.2 超表达载体构建40-43
• 3.2.1 重组子筛选41-42
• 3.2.2 酶切鉴定42-43
• 3.3 RNAi载体的构建43-49
• 3.3.1 pKANNIBAL(+)载体构建43-46
• 3.3.2 pKANNIBAL(+/-)载体构建46-48
• 3.3.3 pART27载体的构建48-49
• 3.4 瞬时表达结果49-53
• 3.4.1 表型观察分析49-52
• 3.4.2 CmERFI-5基因瞬时表达表型分析52
• 3.4.3 CmERFI-13基因瞬时表达表型分析52
• 3.4.4 CmERFI-15基因瞬时表达表型分析52-53
• 3.5 分子检测53-58
• 3.5.1 CmERFI-5、CmERFI-13和CmERFI-15基因的瞬时表达53-54
• 3.5.2 果实成熟相关基因的分子检测54-58
• 4 讨论和结论58-60
• 4.1 讨论58-59
• 4.2 结论59-60
• 参考文献60-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表的学术论文66

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