禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

发布时间：2017-09-20 19:16

  本文关键词：禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

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【摘要】：A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70%;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一。本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)(A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01(H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析。首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得c DNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用Bam HⅠ和NotⅠ双酶切将其定向插入p GEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达。该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出。为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析。结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90%以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好。研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料。
【作者单位】： 甘肃农业大学动物医学院;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室;
【关键词】： 禽流感病毒 NS蛋白 原核表达纯化 热稳定性
【基金】：国家自然科学基金(No.31402206)
【分类号】：S852.65
【正文快照】： 禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种主要流行于禽类的传染病,具有传染性强、传播速度快的特点。一些亚型禽流感病毒,如H5N1、H7N9和H9N2病毒,不仅对家禽具有致病力,而且严重威胁人类公共卫生安全(Li,Chen,2014)。A型流感病毒的基因组

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