泛素基因家族在斑节对虾卵巢发育过程中的功能分析

发布时间：2017-09-20 22:33

  本文关键词：泛素基因家族在斑节对虾卵巢发育过程中的功能分析

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【摘要】：泛素-蛋白酶体是普遍存在于生物体各组织内的蛋白降解通路,它参与了几乎所有动植物体的生命活动,包括细胞增殖、分化;细胞周期调控;膜受体内吞作用;基因的转录与表达等方面,它能通过降解其他通路的抑制因子或激活因子从而调控通路的进程。为了研究该通路在斑节对虾卵巢发育过程中的功能,本研究克隆验证了28泛素家族基因的开放阅读框,其中包括1个泛素前体、5个泛素类似物、2个泛素活化酶、14个泛素结合酶、3个泛素连接酶和3个泛素羧基末端水解酶。利用荧光定量PCR技术检测了这28个基因在斑节对虾性腺不同发育时期的卵巢和肝胰腺中的表达,结果显示在卵巢发育中各基因的表达趋势大体上分为三支,有8个基因的表达总趋势上升(UBE3S、UBE2N、UBFD1、UBE2G1、UBE2J2、UFM、UFM1、UBE2H1);7个基因的表达总趋势下降(UMAE5、UBE、UPL、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3);10个基因的表达呈先升后降的趋势(UCH14、UBE2V2、UBE2Q1、UBE2A、UBE2G2、UBA1、UBE2H、UBE3B1F1、UBE2C、UBE2H5b)。各基因在卵巢不同发育期对应的肝胰腺中的表达结果显示基因的表达趋势大体上分为三支,有12个基因的表达总趋势先降后升(UBE3S、UBE2N、UFM、UBFD1、UBE、UBE2A、UPL、UBE2G1、UBA1、UBE3B1F1);2个基因的表达总趋势上升(UBE2V2、UBE2H1);14个基因的表达呈先降后升,再降的趋势(UCH14、UBE2Q1、UBE2G2、UBE2H、UBE2C、UBE2H5b、UMAE5、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3、UBE2J2、UFM1、UBE2)。根据结果筛选出泛素前体(UBS30)、泛素活化酶E1(UBA1)、泛素结合酶E2(UBE2A、UBE2G1、UBE2G2和UBE2H)6个基因进行进一步的蛋白功能分析。PmUBS30全长为933 bp,开放阅读框为396 bp,编码131个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在胃中表达量最高,心脏次之;构建体外重组表达体系,1mmol/L IPTG、25℃诱导6小时可得到33.5kD左右目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,蛋白浓度为3.13μg/μl。PmUBA1全长为3822 bp,开放阅读框为3120 bp,编码1039个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官和胃中表达量最高,鳃次之;构建体外重组表达体系1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为34kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度为3.20μg/μl;利用重组蛋白制备多克隆抗体,免疫组织化学结果显示UBA1在斑节对虾卵巢不同发育时期中的卵巢中主要定位于细胞质中,且在III期、IV期、V期卵巢中表达较为明显,I期和II期卵巢中无明显表达。PmUBE2A全长为941 bp,开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官表达量最高,胃组织次之,其次是鳃、心脏;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为38 kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度约为2.08μg/μl。PmUBE2G1全长为911 bp,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸;荧光定量结果显示该基因在淋巴器官、鳃组织和胃组织中表达量最高,心脏次之;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为38 kD的目的条带,Western Blot验证目的条带。PmUBE2G2得到片段长为620 bp,开放阅读框为507 bp,编码168个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官和胃中表达量最高,肝胰腺次之,与鳃和心脏组织的差异不显著;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为38kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度约为2.66μg/μl。PmUBE2H得到片段长为1010 bp,开放阅读框为555 bp,编码184个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官表达量最高,鳃次之;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为39kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度约为2.92μg/μl。本实验通过研究泛素家族基因在斑节对虾性腺不同发育时期的卵巢和肝胰腺中的表达,推断这些基因分别参与斑节对虾卵巢卵母细胞分化及卵黄蛋白积累,同时参与肝胰腺卵黄蛋白原的合成及转运。并筛选6个各类基因进行进一步的蛋白功能研究,为进一步研究泛素基因家族在斑节对虾卵巢发育中的调控机制提供参考。
【关键词】：斑节对虾 卵巢发育 泛素家族 荧光定量
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要3-5
• abstract5-8
• 英文缩略词表8-12
• 1 前言12-18
• 1.1 泛素家族基因研究进展12-15
• 1.1.1 泛素家族基因研究12-14
• 1.1.2 泛素家族在性腺发育中的研究14-15
• 1.2 斑节对虾卵巢发育的研究15-16
• 1.3 本研究的目的意义16-17
• 1.4 本研究的主要技术路线17-18
• 2 材料与方法18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 斑节对虾样品制备18
• 2.1.2 主要试剂及仪器18-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 卵巢切片制作20
• 2.2.2 RNA提取及逆转录20-21
• 2.2.3 泛素家族基因的筛选和验证21-24
• 2.2.4 泛素家族基因的全长获得24
• 2.2.5 泛素家族基因的表达情况24
• 2.2.6 生物信息学分析24-25
• 2.2.7 原核表达25
• 2.2.8 SDS-PAGE及免疫印迹25-27
• 2.2.9 蛋白纯化27-28
• 2.2.10 蛋白浓度测定28-29
• 2.2.11 免疫组化29-30
• 3 结果30-68
• 3.1 卵巢切片分期30-31
• 3.2 泛素基因家族的筛选与克隆31-33
• 3.2.1 基因的筛选31
• 3.2.2 泛素家族基因克隆31-33
• 3.3 泛素家族基因的表达分析33-35
• 3.3.1 泛素家族基因在斑节对虾不同性腺发育时期卵巢中的表达33-34
• 3.3.2 泛素家族基因在斑节对虾不同性腺发育时期肝胰腺中的表达34-35
• 3.4 泛素基因家族的蛋白功能研究35-68
• 3.4.1 PmUBS30基因的蛋白功能研究35-40
• 3.4.2 PmUBA1基因的蛋白功能研究40-49
• 3.4.3 PmUBE2A基因的蛋白功能研究49-53
• 3.4.4 PmUBE2G1基因的蛋白功能研究53-58
• 3.4.5 PmUBE2G2基因的蛋白功能研究58-62
• 3.4.6 PmUBE2H基因的蛋白功能研究62-68
• 4 讨论68-77
• 4.1 泛素基因家族在斑节对虾性腺不同发育时期的卵巢和肝胰腺中的表达分析68-70
• 4.1.1 泛素基因家族在卵巢中的表达分析68-69
• 4.1.2 泛素基因家族在肝胰腺中的表达分析69-70
• 4.2 PmUBS30基因的结构及功能70-71
• 4.3 PmUBA1基因的结构及功能71-72
• 4.4 PmUBE2A基因的结构及功能72-73
• 4.5 PmUBE2G1基因的结构及功能73-74
• 4.6 PmUBE2G2基因的结构及功能74-75
• 4.7 PmUBE2H基因的结构及功能75-77
• 5 结论77-78
• 致谢78-79
• 参考文献79-86
• 附录A 引物序列86-91
• 附录B 基因序列91-103
• 附录C 荧光定量PCR结果103-110

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：890811