基于日本沼虾转录组的免疫基因发掘

发布时间：2017-09-21 13:40

  本文关键词：基于日本沼虾转录组的免疫基因发掘

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【摘要】：日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是我国重要的淡水经济虾类。因其培养周期短,市场价格高而备受水产养殖户的青睐。但是近年日本沼虾细菌性疾病的频发已给其养殖业造成了严重损失,而目前缺乏日本沼虾分子免疫机制的研究。因此从分子生物学水平上研究日本沼虾免疫防御机制,对养殖过程中的疾病防控有重要的意义。本研究以日本沼虾为研究对象,利用Illumina高通量测序技术,成功测定了1个转录组和4对细菌刺激后不同时间不同组织的数字基因表达谱(DGE)。利用blastx算法将获得的日本沼虾转录组文库分别在COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot和nr等七大公共数据库进行功能和代谢途径分析注释,并对无脊椎动物中一些重要的免疫基因进行了筛选。同时我们对4对表达谱数据在组织水平和时间水平上分类比较,以期明确日本沼虾免疫基因表达的时空特异性,这个工作有助于从分子生物学水平上揭示日本沼虾的免疫机制。在转录组分析过程中,我们从日本沼虾中鉴定了脊椎动物肿瘤坏死因子(TNF)和脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(Litaf)的同源基因MnTNF和Mn Litaf,并对其在细菌刺激下的表达进行了定量分析。主要结果如下:1.成功构建了日本沼虾转录组文库,获得unigenes共142560条,共有43038条基因得到注释,占转录组总unigenes的30.20%,通过注释信息和手动筛选找到1240条潜在的免疫相关基因,这些基因主要属于模式识别受体、免疫信号转导因子和免疫效应因子。在其他甲壳纲中普遍存在的dFADD和Dredd等保守免疫基因在日本沼虾转录组中没有找到。根据免疫基因的筛选结果,初步绘制了日本沼虾免疫通路图。2.比较日本沼虾不同组织和细菌刺激后不同时间的表达谱,进行免疫相关基因DEG(Differentially Expressed Gene)分析,鉴定了在血细胞和肝胰腺中特异表达的免疫基因,以及细菌刺激后差异表达的免疫基因,初步明确了日本沼虾免疫基因表达的时空特异性。3.首次在虾类中鉴定到TNF超家族成员MnTNF,定量分析结果显示其在鳃中的表达量最高;对MnTNF上游潜在转录因子MnLitaf进行定量分析,结果显示其在血细胞中高表达。在细菌刺激后二者表达量均显著上调,暗示这两个基因在日本沼虾的免疫应答中均扮演重要角色。综上所述,本研究丰富了日本沼虾的遗传数据库,为日本沼虾的疾病防御和健康养殖提供了理论基础。
【关键词】：日本沼虾 转录组文库 免疫相关基因
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 文献综述12-23
• 1.1 日本沼虾简介12
• 1.2 无脊椎动物的防御机制12-19
• 1.2.1 非己识别13-15
• 1.2.2 免疫信号转导15-18
• 1.2.3 效应因子反应系统18-19
• 1.3 TNF与Litaf研究进展19-21
• 1.4 本研究的目的和意义21-23
• 第2章 日本沼虾转录组高通量测序及分析23-34
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 实验菌株23
• 2.1.2 实验动物及处理23
• 2.1.3 实验仪器23-24
• 2.1.4 实验样品处理24
• 2.1.5 日本沼虾总RNA提取24
• 2.1.6 测序文库制备24
• 2.1.7 序列拼接组装24-25
• 2.1.8 unigene功能注释和分类25
• 2.1.9 重要免疫基因的筛选和比较25
• 2.2 实验结果25-32
• 2.2.1 序列组装拼接25-26
• 2.2.2 日本沼虾总转录组的功能注释26-30
• 2.2.3 免疫相关基因筛选与分析30-32
• 2.3 讨论32-34
• 第3章 细菌刺激下的基因表达谱分析34-46
• 3.1 实验材料34
• 3.2 实验方法34-35
• 3.2.1 FPKM标准化处理34
• 3.2.2 免疫基因的组织特异性表达分析34
• 3.2.3 细菌刺激后血细胞中差异表达的基因分析34
• 3.2.4 细菌刺激后肝胰腺中差异表达的基因分析34-35
• 3.3 实验结果35-43
• 3.3.1 组织特异性表达的免疫基因35-38
• 3.3.2 细菌刺激后血细胞中差异表达基因的分析38-40
• 3.3.3 细菌刺激后肝胰腺中差异表达基因的分析40-43
• 3.4 讨论43-46
• 第4章 MnLitaf基因的扩增与表达分析46-55
• 4.1 实验材料46-47
• 4.1.1 实验对象46
• 4.1.2 实验仪器46
• 4.1.3 实验试剂46-47
• 4.1.4 实验引物47
• 4.2 实验方法47-48
• 4.2.1 取材、总RNA提取和cDNA的合成47
• 4.2.2 日本沼虾Litaf（Mn Litaf）基因的扩增47-48
• 4.2.3 生物信息学分析48
• 4.2.4 日本沼虾Litaf（Mn Litaf）的组织表达量分析48
• 4.2.5 日本沼虾Litaf（Mn Litaf）细菌刺激后的表达分析48
• 4.3 实验结果48-54
• 4.3.1 日本沼虾Litaf（Mn Litaf）的扩增与序列分析48-49
• 4.3.2 日本沼虾MnLitaf的生物信息学分析49-52
• 4.3.3 日本沼虾MnLitaf的系统进化分析52-53
• 4.3.4 MnLitaf的组织表达量分析53
• 4.3.5 细菌刺激后MnLitaf在血细胞的表达量分析53-54
• 4.4 讨论54-55
• 第5章 MnTNF基因的扩增与表达分析55-62
• 5.1 实验材料55
• 5.2 实验方法55-56
• 5.2.1 日本沼虾总RNA提取和cDNA的合成55-56
• 5.2.2 日本沼虾TNF（MnTNF）基因的扩增56
• 5.2.3 生物信息学分析56
• 5.2.4 日本沼虾TNF（MnTNF）的组织表达量分析56
• 5.2.5 日本沼虾TNF（MnTNF）细菌刺激后的表达分析56
• 5.3 实验结果56-61
• 5.3.1 日本沼虾TNF（MnTNF）的扩增与序列分析56-58
• 5.3.2 日本沼虾MnTNF的生物信息学分析58
• 5.3.3 日本沼虾MnTNF的系统进化分析58-60
• 5.3.4 MnTNF的组织表达量分析60
• 5.3.5 细菌刺激后MnTNF在血细胞的表达量分析60-61
• 5.4 讨论61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-70
• 致谢70-71
• 读研期间发表的论文71

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