山羊源奇异变形杆菌的分离鉴定及其主要毒力基因的检测

发布时间：2017-09-22 17:33

  本文关键词：山羊源奇异变形杆菌的分离鉴定及其主要毒力基因的检测

  更多相关文章： 山羊 奇异变形杆菌 腹泻 毒力因子 药敏试验 耐药性 致病性

【摘要】：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM)是一种人畜均可感染的条件性致病菌,感染宿主范围广,山羊、猪、鸡、犊牛、狐狸、猕猴、水貂、鸽子、各种鱼类等多种畜禽和野生动物均可感染。PM可引起人的食物中毒和尿道感染,而感染其他动物上会发生不同的疾病,主要有腹泻、创伤感染,也有中耳炎、腹膜炎、脑膜炎的报道。PM属于兼性厌氧菌,并且对生长环境要求不高,低温条件下也可繁殖,极易对动物性食品造成污染,引起人的食物中毒,具有十分重要的卫生学意义。但直到本世纪70年代末期,PM对动物的致病性才受到研究者的关注,从病原学、流行病学等方面做了不同程度的研究。近几年,我国奇异变形杆菌感染人和动物的报道呈上升的趋势,对于畜禽养殖业和人的健康安全造成了极大的危害。山羊腹泻是临床常见病和多发病,导致山羊腹泻的因素有很多,其中细菌、病毒和寄生虫感染是引起山羊腹泻的主要原因。本实验室在前期对成都某羊场的腹泻山羊进行了病原检测,发现奇异变形杆菌与山羊腹泻有密切关系。但目前国内外对山羊源奇异变形杆菌的病原学研究资料甚少,为深入了解其生物学特性,为有效控制其感染提供科学依据,本研究对山羊源奇异变形杆菌进行分离鉴定、对其部分生物学特征进行了研究,并对PM部分毒力基因进行PCR检测,取得如下结果。1山羊源PM的分离鉴定 1.1山羊源PM的培养特性、染色及形态从四川5个地区青白江、简阳、西昌、攀枝花、北川等地7个羊场采集腹泻和健康山羊粪便棉拭子各140份,分别接种于BPW中37℃预增菌培养12h,转种于SC增菌液,37℃培养18h,最后转接种于SS琼脂培养基和LB固体培养基上,37℃培养12h。在SS琼脂培养基上可见光滑、扁平有黑色中心的透明或半透明圆形大菌落,在lb平板上可见典型的“迁徙”生长现象,细菌呈扩散状生长。挑选疑似菌落革兰氏染色镜检,可见革兰氏阴性中等大小的杆菌,无荚膜,不形成芽孢。1.2pcr鉴定挑选疑似菌落接种lb培养基,37℃培养12h,用酚氯仿法提取总dna,采用靶向奇异变形杆菌脲酶调节因子(urer)的引物,扩增其225bp的特异片段,随机挑选5个阳性扩增产物胶回收,连接t载体并测序,证实为pm特异片段。共鉴定出pm41株,其中从腹泻山羊粪便样本中检出31株(31/140),从健康山羊粪便中检出10株(10/140)。用spss软件进行统计学处理,腹泻样本中pm的检出率显著高于健康粪便样本(p=0.02)。由此可见pm与山羊腹泻关系密切。2山羊源pm的耐药性检测采用k-b法检测20株山羊源pm对青霉素类、磺胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类、β-内酰胺类等6大类共15种常用抗菌药物(链霉素、复方新诺明、诺氟沙星、萘啶酸、头孢吡肟、头孢噻吩、阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢曲松、头孢他啶和阿米卡星)的抗性。结果显示:20株被检pm分离株对上述药物的耐药率分别为30%、35%、15%、100%、100%、85%、100%、40%、90%、100%、100%、100%、95%、100%、100%。耐药谱为9~13耐,说明山羊pm的耐药性十分严重,且不同地区山羊奇异变形杆菌的耐药谱和耐药率差异显著(攀枝花地区普遍对青霉素类耐药,简阳地区普遍对β-内酰胺类耐药),这与不同地区羊场的用药习惯有关。因此,定期开展药敏试验,能为山羊pm感染的预防和治疗提供可靠的用药指导。3山羊源pm的致病性随机挑选5株(编号pm1~pm5)从山羊腹泻粪便中分离的pm,分别接种于lb肉汤,37℃培养12h,采用比浊法计数,调整菌液浓度至5×108cfu/ml,腹腔注射2月龄雌性spf昆系小鼠,0.2ml/只,每个菌株接种5只小鼠,同时设5只空白对照,以灭菌生理盐水代替肉汤培养物,各组小鼠隔离饲养,自由采食和饮水,密切观察并纪录小鼠发病及死亡情况。结果显示:空白组5只小鼠在整个试验期间健康状态良好。而5个PM感染组小鼠在8h左右均出现精神沉郁、反应迟钝,闭目蜷缩、扎堆颤抖等症状,10 h开始出现死亡,24 h内全部死亡。死亡小鼠剖检均可见肠管出现明显的充盈、膨胀、肠道内充满黄色粥样稀液内容物,脾脏出现程度不同的肿胀,心脏、肝脏等其他实质器官未见明显病变。上述结果说明,腹腔接种PM对小鼠具有较强的致病性。4山羊源PM主要毒力因子的检测研究和鉴定细菌的毒力基因是研究其感染与致病机理的重要研究内容。本研究选取尿素酶的功能亚单位编码的ureC基因、由金属蛋白酶的主要功能亚单位编码的zapA基因、由MPR菌毛主要结构亚单位编码的mrpA基因、由尿道上皮粘附素结构亚单位编码的ucaA基因、由“雾蔓”迁徙能力的调节基因编码的rsbA基因、由Pmf菌毛主要结构亚单位编码的pmfA基因、由适温菌毛结构亚单位编码的atfA基因、由适温菌毛合成的分子引物编码的atfC基因等8个毒力基因,参照文献报道分别合成这8个毒力基因的引物,PCR分别检测8个毒力基因在10株分自健康山羊粪便样本和20株来自腹泻山羊粪便的PM的携带情况。结果发现:ureC基因在健康山羊和腹泻山羊PM分离株的携带率分别为60%(6/10)和80%(16/20);zap A基因在健康山羊和腹泻山羊PM分离株的携带率分别为50%(5/10),和85%(17/20),经过spss软件进行统计学处理,2个基因在健康山羊和腹泻山羊源PM的携带率差异显著(P=0.04、0.02)。而mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、atfC基因在健康和腹泻山羊中的检出率无明显差异。因此可见,PM携带的ureC和zapA基因可能与致山羊腹泻有关。
【关键词】：山羊 奇异变形杆菌 腹泻 毒力因子 药敏试验 耐药性 致病性
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第一篇 文献综述 畜禽奇异变形杆菌病的研究进展13-20
• 1 分类地位及形态特征13-14
• 2 培养特性14
• 3 病原性14-15
• 4 耐药性15-16
• 5 分子生物学特征16-17
• 5.1 耐药基因16
• 5.2 毒力基因16-17
• 6 流行病学研究进展17-18
• 6.1 奇异变形杆菌的感染谱17
• 6.2 传播途径17
• 6.3 临床症状及病理变化17-18
• 6.4 诊断18
• 7 问题与展望18-20
• 第二篇 研究报告20-41
• 第一章 山羊奇异变形杆菌的分离鉴定及部分生物学特征研究20-33
• 1 材料和方法20-23
• 1.1 样本采集20
• 1.2 发病情况20-21
• 1.3 实验动物与菌株21
• 1.4 主要试剂和仪器设备21
• 1.5 PM的分离培养21
• 1.6 菌体形态和染色特性21
• 1.7 PCR鉴定21-22
• 1.8 耐药表型22
• 1.9 致病性试验22-23
• 1.9.1 菌液的准备22-23
• 1.9.2 动物接种23
• 2 结果23-30
• 2.1 PM的培养特征23-24
• 2.2 PM的形态及染色特征24-25
• 2.3 PCR鉴定结果25-26
• 2.4 PM的耐药表型26-29
• 2.5 PM对小鼠的致病性29-30
• 3 讨论30-33
• 第二章 山羊奇异变形杆菌8种毒力因子的分布研究33-41
• 1 材料与方法33-35
• 1.1 菌株33
• 1.2 主要试剂33
• 1.3 主要仪器33-34
• 1.4 引物设计与合成34
• 1.5 PM DNA的提取34-35
• 1.6 PCR扩增PM毒力基因35
• 2 结果35-39
• 2.1 山羊毒力因子的PCR扩增结果35-38
• 2.2 山羊PM毒力基因的分布38-39
• 3 讨论39-41
• 结论与创新点41-42
• 参考文献42-49
• 致谢49-50

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