Mark4基因通过调控脂肪细胞自噬影响白脂棕色化的分子机制研究

发布时间：2017-09-23 21:12

  本文关键词：Mark4基因通过调控脂肪细胞自噬影响白脂棕色化的分子机制研究

  更多相关文章： Mark4 3T3-L1脂肪细胞 自噬 白脂棕色化

【摘要】：MAP微管亲和调节激酶4(Mark4)属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族成员,调控作用十分广泛。实验室前期研究发现Mark4敲缺鼠表现出食欲增强、活动量增多、代谢率提高,上调棕色脂肪组织(BAT)活性,而超表达Mark4可促进脂滴沉积。自噬是通过溶酶体系统降解胞内错误折叠蛋白和受损细胞器,维持细胞稳态的进化保守过程。抑制脂肪特异性自噬可增加棕色样脂肪细胞数量,有利于脂肪酸氧化和提高胰岛素敏感性。白色脂肪组织棕色化简称白脂棕色化,即是诱导白脂中出现棕色样米色脂肪细胞,增加机体能量消耗。抑制自噬可增加米色脂肪细胞数量,干扰掉Mark4同样可以上调BAT活性,由此推测Mark4-自噬-白脂棕色化有一定联系,而Mark4能否影响自噬与白脂棕色化未见报道。本研究为了明确Mark4调控脂肪细胞自噬与白脂棕色化机制,在3T3-L1脂肪细胞超表达和干扰Mark4基因,得到以下结果:1.Mark4调控血清饥饿诱导的脂肪细胞自噬:血清饥饿8h成功构建脂肪细胞自噬模型。在饥饿模型基础上分析Mark4对自噬的影响,结果表明超表达Mark4显著提高促自噬因子Beclin1、ATG7的表达(P0.05),促进自噬标志蛋白LC3A转化为LC3B(P0.05),抑制P62蛋白表达(P0.05),同时发现自噬泡数量显著增多(P0.05),细胞内绿色荧光蛋白GFP-LC3表达增多(P0.05),干扰Mark4组呈现相反趋势,说明Mark4促进饥饿诱导的脂肪细胞自噬。进一步研究发现超表达Mark4显著提高AMPK磷酸化水平,显著降低AKT磷酸化水平,伴随着LC3A向LC3B转化增多,P62蛋白水平降低(P0.05),干扰组则呈现相反的趋势,说明Mark4通过激活AMPK信号通路、抑制AKT信号通路促进血清饥饿诱导的自噬发生。2.Mark4调控雷帕霉素(Rapa)诱导的脂肪细胞自噬:100nM Rapa处理12h成功构建脂肪细胞自噬模型。在Rapa诱导自噬模型基础上分析Mark4对自噬的影响,结果表明超表达Mark4显著提高促自噬因子Beclin1、ATG7的表达(P0.05),促进自噬标志蛋白LC3A向LC3B转化,抑制P62蛋白表达(P0.05),酸性自噬泡数量显著增多(P0.05),细胞内绿色荧光蛋白GFP-LC3表达增多(P0.05),而干扰Mark4组呈现相反趋势,说明Mark4促进Rapa诱导的脂肪细胞自噬。进一步研究发现超表达Mark4抑制m TOR以及其下游靶分子S6K的磷酸化变化(P0.05),但是AMPK/AKT磷酸化水平没有变化,说明Mark4通过抑制mTOR信号通路促进雷帕霉素诱导的自噬发生,这一过程不依赖AMPK/AKT信号通路。3.Mark4通过调控自噬影响白脂棕色化:冷刺激显著降低WAT中Mark4、Beclin1、ATG7表达,显著提高UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea的表达(P0.05)。冷刺激显著降低BAT中Mark4表达,伴随着Beclin1、ATG7及UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea表达水平升高(P0.05)。HFD饲喂条件下,不管WAT还是BAT中,Mark4表达水平都是显著升高的(P0.05)。WAT中Beclin1、ATG7表达水平显著升高(P0.05),UCP1、PGC1a、Cidea、Prdm16表达水平均没有显著变化(P0.05)。HFD条件下BAT中Beclin1、ATG7及UCP1、PGC1a、Cidea、Prdm16表达水平显著增加(P0.05)。超表达Mark4给予3-MA处理后,UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea的表达均未达到显著水平(P0.05),而干扰组显著促进UCP1、PGC1a、Prdm16、Cidea的表达(P0.05)。油红O染色发现,干扰Mark4给予3-MA处理脂滴变小、变少,说明Mark4通过抑制自噬调控白脂棕色化相关因子表达。综上所述,本研究成功构建饥饿和Rapa两种脂肪细胞自噬模型,明确Mark4通过激活AMPK,抑制AKT/mTOR信号通路促进自噬发生并阐明其调控机理,进一步证实Mark4促进自噬抑制白脂棕色化相关因子表达。
【关键词】：Mark4 3T3-L1脂肪细胞 自噬 白脂棕色化
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q591
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文献综述13-26
• 第一章 MARK4概述13-16
• 1.1 MARKS家族来源与结构13
• 1.2 MARKS家族功能13-14
• 1.3 MARK4结构14-15
• 1.4 MARK4功能研究15-16
• 第二章 自噬研究进展16-22
• 2.1 自噬种类16-18
• 2.2 自噬调节机制18-20
• 2.2.1 自噬体膜来源18-19
• 2.2.2 自噬体成熟19
• 2.2.3 其他调节分子19-20
• 2.3 自噬与脂代谢关系20-22
• 第三章 白脂棕色化研究进展22-26
• 3.1 三类脂肪组织22
• 3.2 调节白脂、棕脂和米脂分化的因子22-23
• 3.3 白脂棕色化相关研究23-26
• 试验研究26-55
• 前言26-27
• 第四章 MARK4促进饥饿诱导的脂肪细胞自噬27-39
• 4.1 材料27-28
• 4.1.1 细胞27-28
• 4.1.2 主要试剂及设备仪器28
• 4.2 方法28-31
• 4.2.1 3T3-L1脂肪细胞复苏、培养及冻存28
• 4.2.2 细胞诱导分化28-29
• 4.2.3 油红O染色29
• 4.2.4 CCK8检测细胞活性29
• 4.2.5 质粒载体提取29
• 4.2.6 质粒载体转染29
• 4.2.7 细胞总RNA提取29-30
• 4.2.8 反转录及实时荧光定量PCR30-31
• 4.2.9 细胞总蛋白提取31
• 4.2.10 Western Blot检测31
• 4.2.11 MDC染色31
• 4.2.12 数据统计及分析31
• 4.3 结果与分析31-37
• 4.3.1 构建血清饥饿诱导 3T3-L1脂肪细胞自噬模型31-33
• 4.3.2 Mark4调控血清饥饿诱导的自噬33-35
• 4.3.3 Mark4调控血清饥饿诱导的自噬的分子机制35-37
• 4.4 讨论37-38
• 4.5 小结38-39
• 第五章 MARK4促进雷帕霉素诱导的脂肪细胞自噬39-47
• 5.1 材料39
• 5.1.1 细胞39
• 5.1.2 主要试剂设备仪器39
• 5.2 方法39-40
• 5.2.13T3-L1脂肪细胞复苏、培养及冻存39
• 5.2.2 细胞诱导分化与油红O染色39
• 5.2.3 CCK8检测细胞活性39-40
• 5.2.4 质粒载体提取与转染40
• 5.2.5 细胞总RNA提取40
• 5.2.6 反转录及实时定量PCR40
• 5.2.7 细胞总蛋白提取40
• 5.2.8 Western Blot检测40
• 5.2.9 MDC染色40
• 5.2.10数据统计及分析40
• 5.3 结果与分析40-45
• 5.3.1 构建Rapa诱导 3T3-L1脂肪细胞自噬模型40-42
• 5.3.2 Mark4调控Rapa诱导的脂肪细胞自噬42-44
• 5.3.3 Mark4调控Rapa诱导的脂肪细胞自噬的分子机制44-45
• 5.4 讨论45-46
• 5.5 小结46-47
• 第六章 MARK4通过调控脂肪细胞自噬影响白脂棕色化47-55
• 6.1 材料47
• 6.1.1 细胞、小鼠47
• 6.1.2 主要试剂47
• 6.1.3 设备仪器47
• 6.2 方法47-48
• 6.2.1 小鼠饲养管理47
• 6.2.2 3T3-L1脂肪细胞复苏、培养及冻存47-48
• 6.2.3 细胞诱导分化与油红O染色48
• 6.2.4 质粒载体提取与转染48
• 6.2.5 细胞总RNA提取48
• 6.2.6 反转录及实时定量PCR48
• 6.2.7 细胞总蛋白提取48
• 6.2.8 Western Blot检测48
• 6.2.9 数据统计及分析48
• 6.3 结果48-53
• 6.3.1 冷刺激影响白脂和棕脂中Mark4、自噬因子及白脂棕色化相关因子表达48-49
• 6.3.2 HFD影响白脂和棕脂中Mark4、自噬因子及白脂棕色化相关因子表达49-50
• 6.3.3 Mark4对抑制自噬条件下脂滴变化的影响50-51
• 6.3.4 Mark4影响白脂棕色化相关因子表达（饥饿诱导自噬模型）51-52
• 6.3.5 Mark4影响白脂棕色化相关因子表达（Rapa诱导自噬模型）52-53
• 6.4 讨论53-54
• 6.5 小结54-55
• 结论、创新点以及进一步研究内容55-56
• 1 结论55
• 2 创新点55
• 3 进一步研究内容55-56
• 参考文献56-64
• 附录64-69
• 致谢69-70
• 作者简介70

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本文编号：907473