PIK3CA和AKT3基因多态性与家兔生长速度关联分析及对骨骼肌卫星细胞增殖的影响

发布时间：2017-09-24 02:06

  本文关键词：PIK3CA和AKT3基因多态性与家兔生长速度关联分析及对骨骼肌卫星细胞增殖的影响

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【摘要】：3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase,P13K)家族是众多原癌基因中极重要的一员,参与多种信号通路,调节细胞的主要生理功能。由P13K与AKT组成的P13K-AKT信号通路在细胞的增殖以及凋亡等过程中发挥至关重要的作用。本试验采用PCR产物直接测序法寻找PIK3CA和AKT3基因的遗传变异,应用PCR-RFLP技术对欧洲大白兔、伊拉兔D系和福建黑兔3个肉兔品种共711个个体进行基因型分析,探讨家兔PIK3CA和AKT3基因的多态性及其与家兔生长速度的相关性。随后选取出生后1d的新西兰仔兔为实验材料,进行分离、纯化家兔骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells,S Cs),并采用siRNA介导的PIK3CA和AKT3基因进行基因的沉默表达,研究其在家兔SCs增殖过程中发挥的作用。主要结果如下：1.通过PCR产物直接测序,在PIK3CA基因序列上共找到6个SNPs位点,分别为：g.12178AG、g.12388CT、g.12605TC、g.12711CG、c.3068AG和c-3377GC。其中c.3068AG为同义突变,位于外显子20。对该位点采用PCR-RFLP的技术进行基因分型并进行关联性分析。、结果发现：c.3068AG位点在欧洲大白和福建黑兔群体中,AG基因型个体的35、56和70日龄体重均显著高于GG基因型个体(P0.05),在伊拉兔D系群体中AG基因型个体35-70日龄的平均日增重则极显著高于GG基因型个体(P0.01)。2.AKT3基因序列上检测到2个SNPs位点,分别为：c.1213AC和g.258389TC。其中c.1213AC为同义突变,位于外显子10。关联性分析表明：c.1213AC位点在欧洲大白兔群体中,A.A基因型个体的35、56和70日龄体重均显著高于CC基因型个体(P0.05)3.针对PIK3CA和AKT3基因,分别采用三对特异的siRNA序列转染SCs,然后qRT-PCR法检测在浓度分别为25nM.50nM.75nM和100nM情况下,转染组和对照组中PIK3CA和AKT3基因mRNA的相对表达量。结果发现使用50nM的si-PIK3CA-003和50nM的si-AKT3-001对细胞内靶基因的mRNA表达水平均有理想的下调作用,对靶基因的抑制效率分别为85.16%和83.93%。4.对处于对数生长期的细胞转染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001 48h后,分别对靶基因和上下游基因PTEN和FoxO1进行qRT-PCR反应。结果表明：在转染si-PIK3CA-003后,PIK3CA和AKT3基因的相对表达量均显著下调,PTEN和Foxo1基因的表达量均显著上调;当转染了si-AKT3-001后,PTEN和Fox01基因表达量均显著上调。表明PTEN、FoxO1基因与PIK3cA、AKT3基因的相对表达量呈负相关。5.选取处于对数期的SCs进行转染实验,采用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测其在转染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001后细胞增殖能力的改变。结果发现：转染实验组OD值显著低于空白对照组(P0.05),说明通过转染实验下调PIK3CA和AKT3基因表达后,细胞增殖能力均有显著的下降。说明PIK3CA和AKT3在SCs的增殖过程中起到重要的作用,能够正向调控肌细胞的增殖。家兔PIK3CA和AKT3基因CDS区的SNPs与生长速度相关,PIK3CA和AKT3基因可作为影响家兔生长速度的重要候选基因,为采用分子育种提高家兔生产性能提供理论依据。通过对PIK3CA和AKT3基因抑制表达,发现PIK3CA和AKT3基因能够正向调控肌细胞的增殖,初步探讨了PIK3CA和AKT3基因在家兔骨骼肌发育过程中的作用。
【关键词】：PIK3CA基因 AKT3基因 SNP SCs 生长
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S829.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文献综述10-20
• 1.1 概述10
• 1.2 动物骨骼肌生长发育10-11
• 1.3 骨骼肌卫星细胞11-13
• 1.3.1 骨骼肌卫星细胞简介11-12
• 1.3.2 骨骼肌卫星细胞的分离方法12-13
• 1.3.3 骨骼肌卫星细胞鉴定13
• 1.4 PI3K-AKT信号通路及相关基因13-17
• 1.4.1 AKT家族14
• 1.4.2 PI3K家族14
• 1.4.3 PI3K-AKT信号通路的功能14-16
• 1.4.4 与PI3K-AKT信号通路相关的上下游基因16-17
• 1.5 RNAi技术的应用17-19
• 1.5.1 RNAi技术的发现17-18
• 1.5.2 RNAi的作用机制18-19
• 1.6 本研究的目的与意义及主要试验内容19-20
• 1.6.1 本试验的目的与意义19-20
• 1.6.2 本试验的主要内容20
• 2 材料与方法20-35
• 2.1 试验动物选择与组织采集20-21
• 2.2 主要设备及器材21
• 2.2.1 分子实验主要设备仪器21
• 2.2.2 细胞培养主要设备和器材21
• 2.3 主要试剂及配制21-22
• 2.4 试验方法22-35
• 2.4.1 耳组织基因组DNA提取22-23
• 2.4.2 DNA浓度及纯度检测23-24
• 2.4.3 PIK3CA、AKT3基因变异位点检测24-25
• 2.4.4 PIK3CA和AKT3基因靶SNPs位点与生长速度关联性分析25-26
• 2.4.5 新西兰兔SCs分离、纯化及培养26
• 2.4.6 SCs的鉴定26-27
• 2.4.7 SCs的传代、冻存和复苏27-28
• 2.4.8 诱导分化和HE染色28-29
• 2.4.9 CCK-8试剂盒检测细胞的增殖29
• 2.4.10 siRNA合成及转染细胞29-31
• 2.4.11 荧光定量PCR反应检测siRNA对靶基因的抑制效果31-34
• 2.4.12 数据处理34-35
• 3 结果与分析35-47
• 3.1 基因组DNA提取结果35
• 3.2 PIK3CA和AKT3基因突变位点的检测和遗传多样性分析35-38
• 3.2.1 PIK3CA和AKT3基因突变位点的检测35-36
• 3.2.2 利用PCR-RFLP对突变位点进行基因分型36-37
• 3.2.3 PIK3CA和AKT3基因遗传多样性分析37-38
• 3.3 家兔PIK3CA和AKT3基因SNP位点不同基因型与生长速度的相关性38-40
• 3.4 兔SCs的鉴定40-42
• 3.4.1 SCs的形态学观察40-42
• 3.4.2 家兔SCs的免疫组化染色鉴定42
• 3.5 免疫荧光鉴定siRNA转染效率42-43
• 3.6 细胞总RNA提取结果43
• 3.7 筛选下调目的基因表达水平的si-PIK3CA和si-AKT343-44
• 3.8 筛选最佳转染浓度44-45
• 3.9 转染siRNA对SCs细胞增殖的影响45-46
• 3.9.1 SCs生长曲线绘制45-46
• 3.9.2 转染siRNA后SCs的增殖能力检测结果46
• 3.10 转染siRNA后上下游相关基因的相对表达量46-47
• 4 讨论47-52
• 4.1 PIK3CA和AKT3基因多态性与家兔生长速度相关47-49
• 4.1.1 c.3068A>G位点与家兔生长速度相关性47-48
• 4.1.2 c.1213A>C位点与家兔生长速度相关性48-49
• 4.2 成功分离、纯化兔SCs细胞49-50
• 4.3 转染si-PIK3CA-003或si-AKT3-001对上下游基因表达量的影响50-51
• 4.4 PIK3CA、AKT3基因对细胞增殖的影响51
• 4.5 PIK3CA、AKT3基因对家兔骨骼肌发育的作用51-52
• 5 结论52-53
• 参考文献53-59
• 致谢59-60
• 攻读学位期间完成的学术成果60

【参考文献】

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本文编号：908726