甘草NCED4基因植物表达载体构建方法及β-AS基因多态性研究

发布时间：2017-09-25 09:31

  本文关键词：甘草NCED4基因植物表达载体构建方法及β-AS基因多态性研究

  更多相关文章： 甘草 甘草酸 根特异性过表达 NCED4基因 脱落酸 β-AS 分子标记 甘草 甘草酸 基因多态性 内含子

【摘要】：甘草是我国常用的大宗药材,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效,被广泛应用于临床配方。甘草酸是甘草的主要药效成分,其含量是我国《药典》规定的重要指标之一。大量研究表明,近年来栽培甘草普遍甘草酸含量较低,达不到《药典》标准,严重制约甘草资源的可持续发展和利用。因此,如何提高甘草中甘草酸含量是保证甘草质量的关键问题。已有研究表明,甘草酸生物合成途径不是孤立存在的,它与其他次生代谢产物如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)、甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)等生物合成途径相互连接并构成网络。本实验室的前期研究发现,外源喷施适当浓度的ABA能够提高甘草中甘草酸的含量,但其作用机制尚未可知。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase,NCED)基因是ABA合成途径中的限速酶基因之一,其表达量直接影响ABA的合成。因此,根据甘草酸生物合成网络我们推测,NCED基因表达量的差异会导致脱落酸含量的差异,进而可能影响甘草酸生物合成途径中关键酶的活性,最终调控甘草酸的合成量。转基因技术是将目的基因插入到植物外植体的基因组中,并使其在后代植株的特定组织中稳定的表达。利用该技术,我们可以考察目的基因在植物体内的过表达情况,进而分析该基因的表达量差异对次生代谢产物生物合成的影响机制。本论文采用转基因技术,尝试用3种方法——基因融合法、多片段一步克隆法以及根特异性通用表达载体法来构建携带甘草NCED4基因的根特异性植物双源表达载体,并将该基因进行遗传转化,最后培育NCED4基因过表达的再生植株。本论文为进一步研究NCED4基因表达量对甘草酸生物合成的调控机制奠定了基础,目前取得的主要成果如下：(1)成功采用多片段一步克隆法构建了携带甘草NCED4基因的根特异性表达载体pCA-TobRB7-NCED4-2,并成功转入到根癌农杆菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-2的构建。(2)成功构建了根特异性通用表达载体pCA-TobRB7并保存。在此基础上,构建了携带甘草NCED4基因的根特异性表达载体pCA-TobRB7-NCED4-3,并成功转入到根癌农杆菌EHA105中,完成了工程菌EHA-TobRB7-NCED4-3的构建。(3)从载体构建准确率、连接效率以及实验周期来分析3种载体构建方法的优劣。从准确率来看,基因融合法经多次重复实验仍出现连入片段不完全的现象,准确率低,因此该种用于方法暂不能用于构建携带甘草NCED4基因的表达载体；而多片段一步克隆法和根特异性通用表达载体法的准确率均较高,测序结果表明,连入目的基因片段完整、顺序正确。从连接效率来看,经多片段一步克隆法构建的表达载体转化感受态细胞后,阳性率仅为50%,效率较低；经根特异性通用表达载体法构建的载体转化感受态细胞后,阳性率为90%,效率较高。从实验周期长短来看,多片段一步克隆法仅需一次即可完成多片段基因重组,实验周期最短；而根特异性通用表达载体法需要分两次完成,第一次完成通用载体的构建,第二次才能将目的基因连入,但在通用载体构建成功后可将其保存,今后如需构建其他根特异性表达载体,在TobRB7启动子序列后选择其他合适酶切位点将目的基因连入即可,从长远来看,根特异性通用表达载体法更为方便快捷、省时省力。综上所述,我们认为根特异性通用表达载体法准确率高、连接效率高、实验周期较短并且应用范围广,是最适用于构建携带甘草NCED4基因的表达载体构建方法；多片段一步克隆法更适用于任何2个以上片段的快速定向克隆,但效率稍低,需严格掌握重组体系中各片段的加入比例。(4)成功通过根癌农杆菌介导法,将含有甘草NCED4基因的工程菌转入甘草下胚轴。之后转入诱导培养基进行根特异性过表达NCED4基因的愈伤组织培养。甘草是中医临床中使用频率最高的药材之一,享有“十药九甘草”之美誉。近年来,栽培甘草已成为甘草药材市场的主流商品,但栽培甘草的甘草酸含量普遍偏低,达不到药典标准,是制约甘草可持续发展的瓶颈。进行优良品种选育是提高甘草酸含量的有效途径。发掘与高甘草酸形成相关的分子标记是进行优良种质资源选育的重要基础,对甘草的分子育种具有重要意义。本文以甘草酸生物合成途径下游中的关键酶基因——13-香树脂醇合成酶(β-AS)基因作为研究对象,采用PCR-测序的方法对其内含子部分多态性进行检测,并尝试分析其内含子多态性与甘草酸含量的相关性,从而筛选出与高甘草酸含量相关的分子标记,为甘草的分子育种奠定基础。本论文的主要成果如下：(1)发现β-AS基因第2内含子506 bp、512 bp,第6内含子1710bp-1717bp、1744 bp、1745 bp,第8内含子2187 bp-2198bp、2216 bp存在变异位点。变异位点类型如下：①单核苷酸多态性(SNPs):甘草β-AS基因内含子共有3处SNPs,在1742 bp处存在T-C颠换,1743 bp存在T-C颠换,2216 bp存在T-G颠换。②等位基因杂合多态性：甘草β-AS基因内含子共有3处等位基因杂合多态性位点,在506bp处存在C/G杂合,512bp处存在C/G杂合,2216 bp处存在T/G杂合。③插入／缺失突变(Tndels):甘草β-AS基因全长共有2处Indels,在1710bp-1016 bp存在AT缺失,在2187bp-2198bp处存在ATATTGACTTAA共12个碱基的缺失。④拷贝数多态性(CNVs):甘草β-AS基因可能存在2个以上拷贝。对164个甘草样本β-As基因内含子进行多态性检测,除去等位基因杂合多态性和拷贝数多态性的样本后,共有138个纯合型样本。(2)运用灰色关联法分析各变异位点与甘草酸含量的相关性,发现1710bp、1712 bp、1714 bp、2187 bp、2189 bp、2193 bp、2197 bp、2198bp位点的碱基类型与甘草酸含量呈显著相关(r0.65)。依据以上8个高关联变异位点将138个纯合型样本划分B1-B5共5种类型,其中B5(1710bpA、1712 bp A、1714 bp A、2187 bp A、2189 bp A、2193 bpA、2197 bp A、2198 bp A)型样本甘草酸含量最高。对138个纯合型样本的甘草酸含量进行聚类分析,按照甘草酸含量由低到高排序为Ⅰ组(0.54%-0.92%)、Ⅱ组(0.97%-1.26%)、Ⅲ组(1.29%-2.46%)、Ⅳ组(2.54%-3.33%),其中,B5(1710bp A、 1712bp A、1714bpA、2187bpA、2189bpA、2193bpA、2197bpA、2198bp A)型样本在4个组之间所占比例存在显著性差异(PB5=0.0020.05),且B5型在甘草酸含量最高组(Ⅳ组)中所占比例最高(66.67%)。综上所述,B5为与高甘草酸含量相关的分子标记。(3)分析了甘草各单倍型与甘草酸含量的相关性。138个纯合型样本可被分为G1-G7共7种单倍型。其中,G7(1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC,2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型样本甘草酸含量最高。对不同单倍型在4个甘草酸含量积累组中所占比例进行分析后发现,G7 (1710-1715 bp ATATAT,1744-1745 bp TC, 2187～2198 bp ATATTGACTTAA,2216 bp G)型样本甘草酸含量在4个组之间所占比例存在显著性差异(PG7=0.0010.05),且G7型在甘草酸含量最高组(Ⅳ组)中所占比例最高(66.67%)。综上所述,G7为高甘草酸含量相关的单倍型类型。(4)综合分析β-AS基因变异位点及单倍型与甘草酸含量相关性,我们发现G7单倍型在1710bp、1712bp、1714bp、2187bp、2189bp、2193bp、2197bp的碱基类型均为A,这与B5这一分子标记类型完全相同,由此我们可以得出一致性的结论,即B5为与高甘草酸含量相关的分子标记,G7为高甘草酸含量相关的单倍型类型。该分子标记所在的第6-第8内含子可作为候选检测区域,用于筛选品质优良的甘草种质资源。
【关键词】：甘草 甘草酸 根特异性过表达 NCED4基因 脱落酸 β-AS 分子标记 甘草 甘草酸 基因多态性 内含子
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.71
【目录】：

• 第一部分 甘草NCED4基因植物表达载体构建方法研究8-66
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 符号说明13
• 前言13-15
• 第一章 文献综述及本论文研究思路15-23
• 1 文献综述15-20
• 1.1 脱落酸生物合成途径及NCED基因家族研究进展15-17
• 1.2 表达载体构建方法研究进展17-20
• 2 研究思路与方法20-23
• 2.1 研究目标20
• 2.2 研究内容20-22
• 2.3 技术路线22-23
• 第二章 烟草TobRB7启动子的克隆23-29
• 1 实验材料、试剂及仪器23
• 1.1 植物材料、菌株及质粒23
• 1.2 试剂23
• 1.3 仪器与耗材23
• 2 实验方法23-26
• 2.1 总DNA的提取23-24
• 2.2 PCR扩增24-25
• 2.3 胶回收纯化25
• 2.4 与克隆载体连接25-26
• 2.5 转化感受态细胞及阳性克隆筛选26
• 2.6 序列分析26
• 3 实验结果26-28
• 4 小结与讨论28-29
• 4.1 小结28
• 4.2 讨论28-29
• 第三章 基因融合法表达载体的构建29-40
• 1 实验材料、试剂及仪器29
• 1.1 菌株及质粒29
• 1.2 试剂29
• 1.3 仪器与耗材29
• 2 实验方法29-34
• 2.1 载体构建原理29-30
• 2.2 引物设计30-31
• 2.3 质粒提取31
• 2.4 带酶切位点及连接位点的基因片段克隆31-32
• 2.5 载体pCAMBIA1305.1双酶切32
• 2.6 基因融合32-33
• 2.7 基因重组33-34
• 2.8 重组质粒的转化34
• 2.9 阳性克隆的筛选及PCR验证34
• 2.10 测序及测序结果分析34
• 3 实验结果34-38
• 3.1 带酶切位点及连接位点的基因片段的克隆结果34-35
• 3.2 载体pCAMBIA1305.1双酶切结果35
• 3.3 基因融合结果35-36
• 3.4 重组载体阳性克隆筛选结果36-37
• 3.5 基因重组结果37-38
• 4 小结与讨论38-40
• 4.1 小结38
• 4.2 讨论38-40
• 第四章 多片段一步克隆法表达载体的构建40-44
• 1 实验材料、试剂及仪器40
• 2 实验方法40
• 3 实验结果40-42
• 3.1 重组载体阳性克隆筛选结果40-41
• 3.2 基因重组结果41-42
• 4 小结与讨论42-44
• 4.1 小结42-43
• 4.2 讨论43-44
• 第五章 根特异性通用表达载体的构建44-50
• 1 实验材料、试剂及仪器44
• 2 实验方法44-46
• 2.1 载体构建原理44
• 2.2 质粒提取44
• 2.3 引物设计44-45
• 2.4 带酶切位点及连接位点的基因片段克隆45
• 2.5 载体pCAMBIA1305.1双酶切45-46
• 2.6 根特异性通用表达载体pCA-TobRB7的双酶切46
• 3 实验结果46-48
• 3.1 pCA-TobRB7根特异性通用表达载体的构建结果46-47
• 3.2 pCA-TobRB7-NCED4-3根特异性通用表达载体的构建结果47-48
• 4 小结与讨论48-50
• 4.1 小结48-49
• 4.2 讨论49-50
• 第六章 甘草根特异性表达工程菌的构建50-52
• 1 实验材料、试剂及仪器50
• 1.1 菌株及质粒50
• 1.2 试剂50
• 1.3 仪器与耗材50
• 2 实验方法50-51
• 2.1 根特异性重组质粒的提取50
• 2.2 根特异性重组质粒转化农杆菌50
• 2.3 阳性克隆的筛选及测序50-51
• 3 实验结果51
• 4 小结51-52
• 第七章 根特异性过表达NCED4基因甘草愈伤组织的培养52-59
• 1 实验材料、试剂及仪器52
• 1.1 实验材料52
• 1.2 试剂、仪器、耗材52
• 2. 培养基及溶液配制52-54
• 2.1 6,7V培养基配方52-54
• 2.2 其他试剂及母液54
• 3. 实验方法54-55
• 3.1 根癌农杆菌工程菌的活化54
• 3.2 甘草外植体材料的制备54-55
• 3.3 侵染、共培养、除菌及愈伤组织的诱导55
• 4. 实验结果55-58
• 4.1 根癌农杆菌工程菌的活化55
• 4.2 甘草外植体材料的制备55-56
• 4.3 侵染、共培养及除菌56-58
• 5. 小结与讨论58-59
• 5.1 小结58
• 5.2 讨论58-59
• 第八章 总结和展望59-62
• 1 总结59-60
• 2 展望60-62
• 参考文献62-66
• 第二部分：基于甘草β-AS基因内含子多态性的高甘草酸含量分子标记研究66-121
• 摘要66-68
• ABSTRACT68-70
• 符号说明70
• 前言70-72
• 第九章 文献综述及本论文研究思路72-81
• 1. 文献综述72-79
• 1.1 分子标记与药用植物有效成分含量的相关性研究进展72-75
• 1.2 甘草中甘草酸含量差异现状的研究进展75-77
• 1.3 甘草酸生物合成途径及β-AS基因多态性研究进展77-79
• 2. 研究思路与方法79-81
• 2.1 研究目标79
• 2.2 研究内容79
• 2.3 研究方案79-80
• 2.4 技术路线80-81
• 第十章 甘草β-AS基因内含子多态性的检测及分析81-89
• 1 实验材料、试剂及仪器81-82
• 1.1 植物材料81
• 1.2 试剂81
• 1.3 仪器和耗材81-82
• 2 实验方法82-84
• 2.1 总DNA提取82
• 2.2 甘草β-AS基因内含子分片段引物设计82-83
• 2.3 PCR反应体系83
• 2.4 PCR反应条件83-84
• 2.5 序列校对拼接84
• 2.6 甘草β-AS基因内含子多态性分析84
• 3 实验结果84-87
• 3.1 甘草β-AS基因内含子片段的PCR结果84-85
• 3.2 β-AS基因内含子测序及BLAST结果85-87
• 3.3 甘草β-AS基因内含子多态性分析87
• 4 小结与讨论87-89
• 4.1 小结87
• 4.2 讨论87-89
• 第十一章 甘草β-AS基因内含子与高甘草酸含量相关的分子标记研究89-113
• 1 实验材料、试剂及仪器89
• 1.1 植物材料89
• 1.2 试剂89
• 1.3 仪器和耗材89
• 2 实验方法89-91
• 2.1 甘草样本甘草酸HPLC法含量测定89-90
• 2.2 甘草β-AS基因各变异位点与甘草酸含量的关联分析90
• 2.3 甘草β-AS基因单倍型与甘草酸含量的相关性分析90-91
• 3 实验结果91-110
• 3.1 甘草酸含量测定结果91-100
• 3.2 甘草β-AS基因各变异位点与甘草酸含量的关联分析结果100-106
• 3.3 甘草β-AS基因单倍型与甘草酸含量的相关性分析结果106-110
• 4 小结与讨论110-113
• 4.1 小结110-112
• 4.2 讨论112-113
• 第十二章 总结和展望113-116
• 1 总结113-114
• 2 展望114-116
• 参考文献116-121
• 致谢121-123
• 个人简历123-124

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 臧艺玫;李妍們;乔晶;陈宏昊;刘春生;;基于β-香树脂醇合成酶基因SNP的甘草道地性机制研究[J];药学学报;2015年07期

2 田亚然;薛t熿，

本文编号：916682