巴斯德毕赤酵母gup1基因（PpGUP1）在甘油和甲醇代谢中的功能研究

发布时间：2017-09-25 23:27

  本文关键词：巴斯德毕赤酵母gup1基因（PpGUP1）在甘油和甲醇代谢中的功能研究

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【摘要】：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白真核表达系统之一,该系统基于一个高效的醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子(AOX1promoter,PAOX1),PAOX1的转录只响应甲醇的诱导,当以甲醇为唯一碳源时,PAOX1启动外源蛋白的表达,当甘油存在时,甘油阻遏aox1的转录。本文分析了毕赤酵母gup1基因(PpGUP1,基因编号:238029505)在代谢甘油和甲醇中的作用,通过基因敲除、异源表达和基因过表达,构建了不同突变体,在不同碳源培养基培养,生物量、碳源代谢速率分析,并从转录水平分析不同碳源培养基中基因的特异性表达,以期探究甘油抑制PAOX1的分子机理。主要研究结果如下:(1)同源重组构建PpGUP1缺陷型菌株GUP1Δ和过表达菌株分别在BMGY、BMMGY培养基培养,甘油利用缺陷型粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe)中异源表达PpGUP1后在以甘油为唯一碳源的培养基培养。生物量及上清甘油含量对比分析,GUP1Δ与P.pastoris生物量及甘油代谢水平无显著性差异,PpGUP1过表达后生物量提高5%,甘油平均代谢速率提高8%,S.pombe中异源表达PpGUP1基因后不能恢复对甘油的利用,通过SDS敏感性实验分析,GUP1Δ细胞透性增强。实验结果表明,毕赤酵母PpGUP1不是甘油转运体,其通过提高细胞透性间接提高甘油吸收速率。(2)在BMMY培养后发现,GUP1Δ较P.pastoris生物量降低约30%,甲醇代谢水平显著降低。SDS-PAGE,Western blot检测AOX1蛋白表达,结果发现GUP1Δ菌株AOX1蛋白的甲醇诱导表达水平显著差于P.pastoris菌株,同时酶活低约50%,PpGUP1过表达后生物量提高6%,AOX1酶活提高10%。进一步分析在不同碳源培养过程中gup1、mxr1和aox1基因的转录水平,敲除PpGUP1后,aox1的基因转录水平显著降低,同时检测mxr1的转录水平下降50%左右,但弱于aox1。PpGUP1在野生菌中过表达后,mxr1和aox1的转录水平均有一定提高。PpGUP1缺失抑制甲醇代谢,推测PpGUP1有两种可能对aox1的调节:一是PpGUP1直接调控aox1的转录;另一种是PpGUP1通过调控mxr1的转录间接调控aox1,这种调控更为严谨。
【关键词】：毕赤酵母 PpGUP1 甘油代谢 甲醇代谢 AOX1 基因转录
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-15
• 1.1 酵母表达系统简介7-11
• 1.1.1 酵母表达系统的发展7
• 1.1.2 毕赤酵母表达系统的特点7-8
• 1.1.3 PAOX1的调控机理研究8-11
• 1.2 碳源阻遏11
• 1.3 甘油转运体研究进展11-13
• 1.4 gup1和gup2研究现状13
• 1.5 本课题的目的和意义13-14
• 1.6 本课题的研究内容14-15
• 第二章 材料与方法15-33
• 2.1 实验材料与试剂15-19
• 2.1.1 菌株质粒15
• 2.1.2 工具酶和分子量标准15-16
• 2.1.3 主要试剂、耗材及试剂盒16
• 2.1.4 主要仪器及配件16-17
• 2.1.5 主要溶液17-18
• 2.1.6 主要培养基18-19
• 2.2 实验方法19-33
• 2.2.1 PpGUP1缺陷型菌株（GUP1Δ）的构建20-24
• 2.2.2 PpGUP1过表达菌株（P. pastoris/pGAPZB+PpGUP1）和缺陷型回补菌株（GUP1Δ/pGAPZB+PpGUP1）的构建24-26
• 2.2.3 PpGUP1异源表达菌株的构建26-27
• 2.2.4 突变体生长曲线的测定27-28
• 2.2.5 甘油及甲醇含量的检测28
• 2.2.6 AOX1蛋白的表达水平及活性检测28-30
• 2.2.7 实时定量PCR检测基因mRNA表达水平30-33
• 第三章 结果与讨论33-51
• 3.1 突变体菌株的构建33-39
• 3.1.1 PpGUP1缺陷型菌株的构建33-37
• 3.1.2 PpGUP1过表达菌株的构建37-38
• 3.1.3 PpGUP1异源表达38-39
• 3.1.4 小结39
• 3.2 毕赤酵母生长特性39-43
• 3.2.1 生物量分析39-40
• 3.2.2 甘油利用能力40-42
• 3.2.3 缺陷型菌株对SDS的敏感性42-43
• 3.2.4 小结43
• 3.3 PpGUP1在AOX1启动子碳源代谢中的作用43-48
• 3.3.1 PpGUP1的敲除抑制细胞代谢甲醇43-44
• 3.3.2 AOX1表达酶活的定量测定44-45
• 3.3.3 AOX1蛋白的SDS、Western bloting检测45-48
• 3.3.4 小结48
• 3.4 PpGUP1在aox1表达差异影响发生在转录水平48-51
• 主要结论与展望51-53
• 主要结论51
• 展望51-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-59
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文59

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本文编号：920223