褐飞虱唾液蛋白的鉴定与基因功能分析

发布时间：2017-09-26 09:39

  本文关键词：褐飞虱唾液蛋白的鉴定与基因功能分析

  更多相关文章： 褐飞虱 唾液蛋白 NlCaM qRT-PCR RNAi EPG 原核表达

【摘要】：褐飞虱有“亚洲水稻头号害虫”之称,而唾液是褐飞虱危害水稻、传播病毒最主要的媒介,在褐飞虱取食过程中扮演着重要角色；研究褐飞虱唾液,对在分子水平上明确褐飞虱危害水稻的机制以及建立新型有效的防治策略具有重要意义。本文通过Parafilm膜夹营养液的方法,收集了3组共计24000头褐飞虱的唾液,再利用质谱技术测定褐飞虱唾液中的蛋白,通过整合分析,首次成功地从褐飞虱唾液中直接鉴定得到206个褐飞虱唾液蛋白及其编码基因。从中选取12个基因,进行实时荧光定量PCR以及RNAi分析。发育特异性表达显示其中有9个基因的雄虫相对表达量高于雌虫；组织特异性表达显示有8个基因均在唾液腺表达量最高,其中6个为唾液腺特异性表达。RNAi表明12个基因中的1个基因—--NlCaM的沉默,具有明显的致死作用。NICaM基因的ORF长450bp,编码一种由149个氨基酸组成、预计分子量为16.4kDa的钙调素蛋白,具有典型的EF-hand结构域。qRT-PCR表明NlCaM基因在唾液腺表达量最高,各发育时期表达差异不大,雄虫略高。沉默NlCaM基因后,褐飞虱发育畸形,羽化后体色变黑、翅膀卷曲；致死率达到100%；发育历期延长；同时褐飞虱的取食量和取食行为发生变化,蜜露分泌量测定结果表明褐飞虱取食量减少,EPG结果表明褐飞虱的刺探时间延长且在木质部的取食时间减少,取食困难。综上,NlCaM基因在褐飞虱取食过程和其他生理生化代谢中均有重要作用。本结果揭示了褐飞虱唾液蛋白的组成,扩展了我们对刺吸式口器昆虫唾液的认识,也为用RNAi技术防治褐飞虱提供了潜在靶标基因。
【关键词】：褐飞虱 唾液蛋白 NlCaM qRT-PCR RNAi EPG 原核表达
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.112.3
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-11
• 第1章 文献综述11-19
• 1.1 植食性刺吸式昆虫唾液的组分与功能11-14
• 1.1.1 唾液在植食性刺吸式昆虫取食过程中的基础作用11-12
• 1.1.2 唾液在植食性刺吸式昆虫诱导植物防御中的作用12-13
• 1.1.3 唾液在植食性刺吸式昆虫抑制植物防御中的作用13-14
• 1.2 RNAi在昆虫基因功能研究中的应用14-15
• 1.3 褐飞虱唾液蛋白研究的目的与意义15-17
• 1.4 技术路线17-19
• 第2章 褐飞虱唾液蛋白的获取与鉴定19-23
• 2.1 材料与方法19-21
• 2.1.1 供试褐飞虱与水稻19
• 2.1.2 实验试剂与工具19-20
• 2.1.3 毛果芸香碱诱导法收集褐飞虱唾液20
• 2.1.4 Parafilm膜夹营养液法收集褐飞虱唾液20-21
• 2.2 结果与分析21-23
• 第3章 褐飞虱唾液蛋白基因的时空表达特异性23-29
• 3.1 材料与方法23-25
• 3.1.1 收集褐飞虱各发育阶段与各组织的样本23
• 3.1.2 提取褐飞虱各样本的RNA23-24
• 3.1.3 反转录24
• 3.1.4 实时荧光定量PCR24-25
• 3.2 结果与分析25-29
• 3.2.1 褐飞虱唾液蛋白基因的组织表达特异性25-26
• 3.2.2 褐飞虱唾液蛋白基因的发育表达特异性26-27
• 3.2.3 褐飞虱唾液蛋白基因在长短翅雌雄虫中的表达差异27-28
• 3.2.4 分析讨论28-29
• 第4章 褐飞虱唾液蛋白基因NlCaM的RNAi29-45
• 4.1 材料与方法29-34
• 4.1.1 虫源与菌株29
• 4.1.2 主要试剂与工具29-30
• 4.1.3 NlCaM基因的序列分析与克隆30
• 4.1.4 dsRNA的体外合成与显微注射30-32
• 4.1.5 dsRNA的干扰效果检测32
• 4.1.6 dsNlCaM干扰后褐飞虱的存活率统计32
• 4.1.7 dsNlCaM干扰后褐飞虱的发育历期变化32
• 4.1.8 dsNlCaM干扰后褐飞虱的取食量变化32-33
• 4.1.9 dsNlCaM干扰后褐飞虱的取食行为变化33-34
• 4.2 结果与分析34-45
• 4.2.1 NlCaM基因的序列分析与克隆34-35
• 4.2.2 NlCaM基因的时空表达模式35-36
• 4.2.3 NlCaM基因的RNAi沉默效果36-37
• 4.2.4 沉默NlCaM对褐飞虱形态、存活率、发育历期的影响37-38
• 4.2.5 沉默NlCaM对褐飞虱取食量与取食行为的影响38-42
• 4.2.6 NlCaM基因的分析与讨论42-45
• 第5章 褐飞虱唾液蛋白基因NlCaM的抗体制备45-49
• 5.1 材料与方法45-48
• 5.1.1 实验主要试剂配制45-46
• 5.1.2 实验方法46-48
• 5.2 结果与分析48-49
• 总结与展望49-51
• 参考文献51-57
• 在读期间发表论文57-59
• 致谢59

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1 黄晓慧;褐飞虱唾液蛋白的鉴定与基因功能分析[D];浙江大学;2016年

2 王晓菲;卡马西平唾液浓度与血液浓度的相关性及其影响因素的研究[D];第四军医大学;2001年

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本文编号：922756