转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测

  本文关键词：转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测，由笔耕文化传播整理发布。

转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测

转基因大豆、玉米、 转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式 PCR 技术检测

近年主要转基因粮食作物大豆、玉米和水稻加工产品已应用于食品制造业，为此，食品中转基因成 分的安全性受到广泛关注。当前，国际贸易和各国食品工业等部门对转基因产品逐步实施 IP(Identity Preservation)管理，加强检测监控。 深加工品经过若干道加工程序，理化性质变

化、 DNA 断裂，转基因成分检测的难度大大增加。目 前，国际上没有统一的针对转基因粮食作物深加工产品的检测标准，而我国也没有建立有效的检测标准 对市场上常见的转基因大豆、玉米和水稻深加工产品中的主要外源 CrylA (B)、BAR、CP4 EPSPS 和 PAT 基因进行检测。 五重巢式 PCR 是近几年出现的检测技术， 它结合了巢式 PCR 的高灵敏度和多重 PCR 的快速、 简单 和高特异性特点，可以减少假阳性，可以同时检测多个基因片段，可以使检测灵敏度的下限提高几千倍 ‘3]。五重巢式 PCR 方法快速、灵敏度高，在人和动物疾病检测和病毒鉴定中应用较多。目前该技术在 转基因检测中的应用还较少，仅在转基因大豆深加工制品和转基因水稻种子的检测中有半巢式 PCR 应 用的报道。但这些技术仅能对转基因大豆或水稻单一品种进行检测，在做不同品种或品系转基因成分检 测时，需要分别试验，比较繁琐。迄今为止，还没有快速、高通量同时检测不同品种和不同品系的转基 因大豆、玉米和水稻外源基因的报道。本研究旨在建立五重巢式 PCR 体系，探索粮食深加工产品中的转 基因成分，实现不同品种和不同品系粮食作物转基因成分的高通量检测，为转基因深加工产品检测标准 的建立提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料 转基因 RR 大豆购自美国孟山都公司；转基因玉米 Bt11、Bt176 由吉林农科院惠赠；转基因水稻 由农业部转基因生物安全管理办公室提供；转基因玉米 MON810、TC1507、T25 和 CBH-351 购自 香港基因芯片公司，作为阳性对照。非转基因大豆、玉米和水稻由东北农业大学农学院提供，作为阴性 对照。待检深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉 米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片（含有稻米成分）和玉米泥均购自超市，均未注明是否含有转 基因成分。 1.1.2 试验试剂 Wizard@试剂盒，Promega 公司(Madison， USA)；Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×PCR 缓冲 液（含 MgC12）、DL DNA2000 分子质量标准，大连宝生物工程有限公司；特异引物，上海英俊生物 公司。 1.1.3 仪器设备 高速离心机（上海安亭公司，TDL-40B 型）、 PCR 仪（德国 Biometra，Biometra Tgradient 型）、核酸电泳仪（杭州托普仪器有限公司，GE-100 型）、紫外分光光度仪（美国 BECKMAN，DU@ 640 型）、凝胶成像系统（美国 UVP，G8000 型）。 1.2 方法 1.2.1 DNA 提取 将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质量比混合成标准品， 取标准品和待测样品（按操作说明要求的质量）分别根据 Wizard@试剂盒操作说明进行 DNA 提取，并

用紫外分光光度计将 DNA 溶液稀释至同一质量浓度(50 ng/uL)。 1.2.2 引物设计 利用 Primer Premier V5.0 软件进行五重巢式 PCR 的引物设计，用 Oligo V6.22 软件筛选出引 物之间互相干扰最小的引物，引物所扩增目的片段及扩增产物大小见表 1。 1.2.3 五重巢式 PCR 反应体系 1)第 1 轮五重 PCR 反应体系及反应条件。 在第 1 轮五重 PCR 反应体系中， DNA 模板 1uL(50 ng)，， 加 dNTP 各 0.4 mmol/L， 2×PCR 缓冲液， 引物混合液工 （CP4 WF/ CP4 WR， 0.8umol/L;Rbcl WF/Rbcl WR,0.3 umol/L;CryWF/Cry WR,0.25 umol/L;BAR WF/BAR WR,0.4umol/L; Pat WF/Pat WR， 0.4 ptmol/L;)10 uL，DNA 聚合酶 4 U，补去离子水至 50 uL。 扩增条件为：95℃预变性 10 min; 95℃30 s，65℃60 s，72℃60 s，10 个循环；95℃30 s， 62℃60 s，72℃60 s，10 个循环；95℃30 s，60℃60 s，72℃60 s，10 个循环；95℃30 s，58℃ 60 s，72℃60 s，10 个循环：72℃，10 min。 2)第 2 轮五重 PCR 反应体系及反应条件。取第 1 轮五重 PCR 产物 1_uL 作为模板，进行五重巢式 PCR 第 2 轮扩增。 反应体系中加引物混合液Ⅱ(CP4 NF/ CP4 NR,0.6umol/L; Rbcl NF/Rbcl NR,0. 25 umol/L; CryNF/Cry NR,0.5umol/L; BAR NF/BAR NR,0.3 umol/L;Pat NF/Pat NR,0.6 umol/L;)10 uL，DNA 聚合酶 4U，其余步骤同前。 扩增条件同上。 3)检测方法的灵敏度分析。将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质 量比混合， 使样品转基因成分的含量分别达到 5%、 1%、 5×10-1%、 5×10_2%、 5×10_3%、 10-3%、 5×10_4%和 10-4%。用上述 PCR 方法对含混合 DNA 样品进行灵敏度测试。 4)扩增产物检测。 两轮多重 PCR 扩增产物用琼脂糖电泳检测，琼脂糖胶质量分数为 3%，胶中溴化乙锭质量浓度为 0.5ug/mL，电泳缓冲液为 1× TAE，以 DL-2000 DNA 做分子质量标准，电泳条件为 10 V/cm 电压， 电泳 lh。 2 结果与分析 2.1 DNA 提取 本研究所选材料均是深加工制品，测量所提取 DNA 样品的 OD260 值小于 0.1 以及 OD260/OD280 也小于 1.5，进行电泳检测时也观察不到 DNA 条带（图 1），说明所提取 DNA 样品 浓度很低。 用普通 PCR 扩增是检测不出结果的， 但用随后的五重巢式 PCR 进行扩增却可以检测到清楚 的目的带，说明使用 Wizard@试剂盒提取的 DNA 可以满足五重巢式 PCR 扩增的需要。 2.2 五重巢式 PCR 样品检测 第 1 轮扩增结果见图 2(a)，该体系扩增出阳性对照的 CP4-EPSPS 基因、RBCL 基因、CrylA (B) 基因、 BAR 基因和 PAT 基因， 扩增片段大小分别为 498、 433、 321、 201 和 160 bp 及阴性对照的 RBCL 基因。阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；阴性对照结果表明实验过程中无假阳性 结果，排除转基因成分污染的可能；空白对照无扩增条带说明无污染。但其他泳道未看到扩增结果，表 明深加工制品中 DNA 含量非常低，普通的 PCR 反应无法进行转基因检测。 第 2 轮扩增结果(图 2(b))显示，卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出 RBCL 基 因和 CP4-EPSPS 基因片段，即以上 4 种样品含有转 CP4-EPSPS 基因成分；玉米淀粉和玉米泥中扩增 出 RBCL 基因、CrylA (B)基因和 PAT 基因片段，即以上 2 种样品含有转 CrylA (B)基因和 PAT 基因 成分； 玉米蛋白粉扩增出 RBCL 基因、 CrylA(B)基因和 BAR 基因片段， 即含有转 CrSA (B)基因和 BAR 基因成分；营养麦片扩增出 RBCL 基因和 CrylA (B)基因片段，即含有转 CrylA (B)基因成分；大豆精 炼油大豆色拉油和玉米油未检出任何条带，即未从这 3 种样品中提取出 DNA。表明经过第 2 轮的巢式

PCR 扩增，可以检测出除精炼油外的深加工制品的转基因成分。 2.3 五重巢式 PCR 灵敏度分析 在第 1 轮五重 PCR 灵敏度分析实验中，5× lO_1%的阳性混合标准品中利用 5 对外引物能够同时 扩增出 5 个目的基因片段，在 5×10-2G 的阳性 t 昆合标准品中只能扩增出 RBCL 基因、CrylA (B)和 PAT 基因，说明第 1 轮五重 PCR 的灵敏度为 0.5%（图 3）。 在第 2 轮五重 PCR 灵敏度分析实验中，5×10-3%的阳样性混合标准品中能够同时扩增出较为清 晰的 5 个目的基因，1×10-3%的阳性混合标准品 中只能扩增出 RBCL 基因、CP4-EPSPS 基因和 CrylA (B)基因，5×10_ 40 的阳性混合标准品中 只能扩增出 RBCL 基因和 CrylA (B)基因，说明五重巢式 PCR 的灵敏度为 5×10_3%（图 4）。 3 结论与讨论 1)本试验针对转基因市场上常见的转基因粮食作物大豆、玉米和水稻的主要外源 CrylA (B)基因、 BAR 基因、CP4EPSPS 基因、PAT 基因及共同的内标准基因 RBCL 基因的特点设计了 10 对引物，建 立了五重巢式 PCR 体系，其检测灵敏度达到 0.005%，对 11 个大豆、玉米和水稻深加工制品进行了 五重巢式 PCR 检测， 检测出除大豆精炼油、 色拉油和玉米油以外的所有深加工产品的主要外源 CrylA(B) 基因、BAR 基因、CP4-EPSPS 基因、 PAT 基因及共同的内标准基因 RBCL 基因，结果表明本研究建 立的五重巢式 PCR 检测方法适用于主要转基因粮食作物深加工产品的定性检测。 深加工转基因产品中 DNA 提取需要大量的样品材料才能得到足够的 DNA 进行分析。 由于深加工食 品中 DNA 模板含量少，需要利用高效的或特殊的 DNA 提取方法，以提取到其中微量的 DNA。使用普 通的 DNA 和其他试剂盒进行 DNA 提取， 不能扩增得到 PCR 产物， 说明 DNA 提取失败。 利用 Wizard@ 试剂盒，可有效提取到所选 11 种样品中 8 种样品的 DNA 模板。实验表明，豆油和玉米油中的 DNA 在 产品制备过程中已遭到极为严重的破坏和降解并且含量极低，对豆油和玉米油已无转基因检测的必要， 而其他深加工产品均可使用此试剂盒进行 DNA 模板提取。 外源基因在转入植物中时，作了不同程度的修饰和改造，导致不同品种、品系的转基因植物中相同 基因的 DNA 序列有很大差异。如 CrylA (B)基因在抗虫水稻和抗虫玉米中就不相同，并且在玉米的不 同品系如 BTll、BT176 和 MON810 中也不相同，这样就给检测这些基因造成了很大麻烦，对于不同品 种甚至不同品系转基因植物的检测都需要设计不同的引物进行 PCR 扩增。 本试验对同一目的基因在不同 品种和不同品系中的序列进行分析，在保守区域设计多对引物，筛选出了可以在不同品种和不同品系中 通用的引物进行检测， 所设计的 CrylA(B)基因引物可以同时扩增转基因玉米 BT11、 BT176、 MON810 和转基因水稻中的 CrylA(B)基因；PAT 基因引物可以同时扩增转基因玉米 BT11、T25 和 TC1507 中 的 PAT 基因；BAR 基因引物可以同时扩增转基因玉米 BT176 和 CBH351 中的 BAR 基因，大大提高 了检测效率。 2)此外，本研究将大豆、玉米和水稻中共同的内参照基因 RBCL 基因也同时放到 PCR 体系中进行 扩增。 内对照的设置对于植物转基因成分 PCR 检测结果的准确性来说是非常重要的。 以植物体中肯定含 有的基因成分为内参照对其进行扩增，如果内参照基因扩增成功，则表明模板 DNA 质量、数量符合检 测需要。如果内参照基因扩增失败，则表明扩增体系中含有抑制成分，需对模板质量、数量进行优化以 消除抑制因子。显然，内参照的设立是衡量模板 DNA 质量，从而排除由模板中杂质造成的假阴性结果 的一个有力措施。 自从权洁霞对 23 种植物进行分析， 找到了转基因植物检测通用的内源参照基因-RBCL 基因后， RBCL 基因作为内源参照基因广泛应用于番木瓜、 番茄、 水稻和草莓的转基因检测中， 表明 RBCL 基因可以作为植物内源参照基因进行转基因检测，改变了现行的“一种植物一种检测内对照”的情况，大 大提高了检测效率， 降低了检测成本。 本研究中也对 RBCL 基因在大豆、 玉米和水稻的扩增进行了分析， 发现 RBCL 基因在大豆、玉米和水稻中都得到稳定扩增。因此，本试验选用了大豆、玉米和水稻中通用 的内参照基因 RBCL 基因，不但可有效地防止假阴性结果的出现，而且还可以提高检测效率、缩短检测

周期。 在五重巢式 PCR 体系的建立中，影响复合 PCR 反应的因素很多，其中最重要的是引物浓度。通常 根据扩增条带质量调整不同引物的浓度，降低过亮条带的引物浓度，增加条带过暗的引物浓度，直至最 佳扩增结果。有研究表明，扩增片段较大的，所用引物浓度应该大一些，而扩增片段小的引物浓度可以 相对小一些，有时几乎成正比例。而本研究结果与上述有所差别，因此，各种引物扩增所需的浓度并没 有统一的规定，必须通过实验反复验证才能确定。 3)扩增片段的长度也是深加工制品转基因检测过程中的至关重要的因素，由于技术处理使得 DNA 断裂或降解，从而导致假阴性结果。因此，在设计引物时尽量将扩增片段大小控制在较小范围内，避免 扩增片段大导致假阴性结果和扩增片段小降低反应特异性的缺点。本实验设计的内、外两组特异性引物 （每组 5 对引物），扩增片段大小都在 100～500 bp，保证试验结果的准确性，避免假阴性结果的出 现，同时设立空白对照、阴性对照和阳性对照可有效排除假阳性和假阴性结果。 4)五重巢式 PCR 检测体系最终灵敏度应以第二轮五重 PCR 反应的灵敏度(0.005%)为准，即五重 巢式 PCR 检测体系可检出转 CP4-EPSPS 基因、CrylA(B)基因、 BAR 基因和 PAT 基因的量达 0． 005% 以上的样品。此检测体系灵敏度稍高于 Zimmermann 等人用巢式 PCR 方法对转基因玉米进行检测所 得灵敏度(0.01%)； 而远远高于利用多重 PCR 方法进行转基因检测的灵敏度， Roberta 等应用五重巢 式 PCR 对 Alphaviruse 病毒进行检测和鉴定，将灵敏度提高 1 000 倍；而本试验将灵敏度提高 100 倍，这可能是多重 PCR 中各引物之间的干扰使扩增效率下降导致的，但 o．005%的灵敏度已经能够满 足深加工产品检测需要。试验数据表明，本五重巢式 PCR 的灵敏度已经达到国际领先水平，完全适用于 大豆、玉米和水稻深加工产品的检测，并且可以将此技术试用于其他产品或其他研究领域。



更多搜索：转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测

  本文关键词：转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测，由笔耕文化传播整理发布。