玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族鉴定及Clpg1在致病性中的作用

发布时间：2017-09-28 05:39

  本文关键词：玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族鉴定及Clpg1在致病性中的作用

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【摘要】：由新月弯孢[Curvularia lunata(Walker)Boed.]引起的玉米弯孢叶斑病曾在我国北方玉米产区大发生,造成严重的产量损失,随后不断蔓延至全国,成为玉米生产上的重要病害。本研究采用生物信息学方法对玉米弯孢叶斑病菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因家族进行了鉴定和序列特征分析;研究了该基因家族在果胶诱导下的不同生长时期和在病菌与寄主互作中的表达模式;采用基因敲除手段,明确了多聚半乳糖醛酸酶家族成员Clpg1基因在玉米弯孢叶斑病菌致病性中的作用,主要研究结果如下:1.采用生物信息学方法,从玉米弯孢叶斑病菌中鉴定出4个多聚半乳糖醛酸酶基因家族成员,分别命名为Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4,其编码蛋白的氨基酸最长的序列包含有449个氨基酸残基,最短的含有273个氨基酸残基,4个Clpg基因编码蛋白的分子量大小范围为27.4~48.5 kD,等电点范围为5.53~9.19,通过对基因结构和保守结构域的分析,发现4个Clpg基因的外显子和内含子数量相同,与来源其他真菌中的PG基因具有相同的保守结构域;通过亲缘关系分析,发现Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4被分为两个大分支,Clpg1、Clpg2和Clpg3处于同一个分支,分别与稻平脐蠕孢菌(Bipolaris oryzae)、番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)和玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中的PG基因亲缘关系较近;Clpg3与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)的PG基因处于同一分支上,亲缘关系较近。2.采用实时荧光定量PCR技术,分析了玉米弯孢叶斑病菌的4个Clpg基因在果胶诱导的不同时期和病原-寄主植物互作时期的表达情况,结果表明Clpg1、Clpg2和Clpg4在第2 d表达最高,Clpg3在诱导培养第4 d表达最高;病原与寄主互作3 h时,Clpg1和Clpg3的表达量达最高;在接种后24 h时,Clpg2和Clpg4基因表达量最高,以上结果表明Clpg基因可能在病菌侵染过程中起一定作用。3.通过Double-joint PCR法构建Clpg1的基因敲除载体;通过PEG介导的遗传转化,获得抗性转化子79株;通过PCR和RT-PCR技术从抗性转化子菌株中获得一个Clpg1基因的敲除突变菌株(△Clpg1)。4.通过对△Clpg1基因敲除突变体的生物学特性和致病性分析,结果显示△Clpg1突变菌株的孢子萌发率和孢子产量下降;△Clpg1多聚半乳糖醛酸酶的酶活性比野生型菌株DQ-1下调了16%,通过对离体叶片接种实验发现△Clpg1致病性比野生型菌株DQ-1致病性弱,表明玉米弯孢叶斑病菌Clpg1基因影响多聚半乳糖醛酸酶活性,导致致病性降低。
【关键词】：玉米弯孢叶斑病菌 多聚半乳糖醛酸酶 Clpg基因 基因敲除
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.13
【目录】：

• 摘要4-6
• 英文摘要6-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1.1 玉米弯孢叶斑病研究概况12-14
• 1.1.1 玉米弯孢叶斑病菌发生与危害12-13
• 1.1.2 玉米弯孢叶斑病菌生物学特性13
• 1.1.3 玉米弯孢叶斑病菌致病机理13-14
• 1.2 植物病原菌多聚半乳糖醛酸酶研究概况14-17
• 1.3 基因功能研究方法17-19
• 1.3.1 生物信息学分析方法17-18
• 1.3.2 基因功能验证方法18-19
• 1.4 研究目的与意义19-20
• 第二章 玉米弯孢叶斑病菌多聚半乳糖醛酸酶基因家族成员鉴定20-32
• 2.1 材料与方法20-23
• 2.1.1 供试菌株20
• 2.1.2 主要试剂及培养基20
• 2.1.3 玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族成员鉴定及生物信息学分析20-21
• 2.1.4 PG基因家族成员的基因结构分析及系统进化树构建21
• 2.1.5 PG基因诱导时期和病菌与寄主植物互作时期表达分析21-23
• 2.2 结果与分析23-30
• 2.2.1 PG基因家族成员鉴定23-24
• 2.2.2 Clpg基因家族成员保守结构域预测24-25
• 2.2.3 Clpg基因家族成员基因结构分析25
• 2.2.4 Clpg基因家族成员系统进化树构建25-28
• 2.2.5 Clpg基因家族成员在果胶不同诱导时期表达量分析28-29
• 2.2.6 Clpg基因家族成员在病原菌与寄主植物互作过程中不同时期表达量分析29-30
• 2.3 结论与讨论30-32
• 第三章 玉米弯孢叶斑病菌Clpg1基因敲除及突变体鉴定32-44
• 3.1 材料与方法32-39
• 3.1.1 主要试剂与培养基32-33
• 3.1.2 供试菌株及质粒33
• 3.1.3 多聚半乳糖醛酸酶Clpg1基因敲除载体构建33-37
• 3.1.4 PEG介导玉米弯孢叶斑病菌Clpg1基因敲除与敲除突变体筛选37
• 3.1.5 玉米弯孢叶斑病菌Clpg1基因敲除突变菌株鉴定37-39
• 3.2 结果与分析39-42
• 3.2.1 Clpg1基因敲除载体构建39-40
• 3.2.2 PEG介导的Clpg1基因敲除40-41
• 3.2.3 Clpg1基因敲除突变体菌株筛选及检测41-42
• 3.3 结论与讨论42-44
• 第四章 Clpg1基因敲除突变体菌株生物学分析44-52
• 4.1 材料与方法44-46
• 4.1.1 供试菌株及主要培养基44
• 4.1.2 Clpg1基因敲除突变体菌株△Clpg1菌落形态观察44
• 4.1.3 Clpg1基因敲除突变体菌株△Clpg1孢子形态观察及产孢能力测定44-45
• 4.1.4 Clpg1基因敲除突变体菌株△Clpg1孢子萌发率测定45
• 4.1.5 Clpg1基因敲除突变体菌株△Clpg1附着胞观察45
• 4.1.6 Clpg1基因敲除突变体菌株△Clpg1多聚半乳糖醛酸酶酶活性测定45
• 4.1.7 Clpg1基因敲除突变体菌株△Clpg1对离体叶片致病性检测45-46
• 4.2 结果与分析46-50
• 4.2.1 Clpg1基因缺失对菌落形态影响46
• 4.2.2 Clpg1基因缺失对孢子形态及产孢能力的影响46-47
• 4.2.3 Clpg1基因缺失对孢子萌发率的影响47-48
• 4.2.4 Clpg1基因缺失对附着胞的影响48
• 4.2.5 Clpg1基因缺失对多聚半乳糖醛酸酶酶活性的影响48-49
• 4.2.6 Clpg1基因缺失对致病性的影响49-50
• 4.3 结论与讨论50-52
• 第五章 结论52-54
• 参考文献54-62
• 致谢62-64
• 个人简历64-66
• 附录66

【参考文献】

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本文编号：934101