一个拟南芥耐硒基因的克隆及功能分析

发布时间：2017-09-29 17:08

  本文关键词：一个拟南芥耐硒基因的克隆及功能分析

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【摘要】：硒是一种重要的微量元素,适量的硒能预防疾病、延缓衰老、抵抗多种外界胁迫对机体造成的损害,过量的硒则会有毒害作用,因此,探讨植物对硒耐受机制,找出真正的植物耐硒关键因子具有重要的理论意义和实践价值。本文从化学激活型XVE系统中筛选出功能缺失型突变体vse2,鉴定其对硒有一定的耐受性,通过Tail-PCR技术克隆该基因,并初步解析该基因调控硒耐受的分子机理。结果如下：1.从拟南芥XVE突变体库中,筛选获得耐硒突变体vse2,在30μM Na2SeO3和10μM p-estradio+30μM Na2SeO3的培养基中,突变体vse2均表现出耐硒性状,说明突变体vse2对硒的耐受性与P-estradiol无关。2.利用Tail-PCR技术,克隆了拟南芥VSE2基因,该基因为TPS22(Atlg33750),编码一个可能的萜类合成酶,T-DNA插入TPS22基因起始密码子ATG下游第一个外显子的第29个碱基处。基因同源性和氨基酸序列比对的结果显示,TPS22基因有较高的保守性,并且与琴叶拟南芥有较高的相似性。3. TPS22基因在突变体vse2中表达量降低,说明该突变体是基因敲除型突变体。另外,TPS22基因在不同组织中表达量水平有差异性,在根中表达量最高,在花中表达量最低。4.硒胁迫下,突变体vse2根部和茎部组织中的硒含量均较WT低,同时检测了磷转运体HT1;1,发现PHT1;1在突变体vse2中的表达量也降低,推测突变体vse2体内积累较少的硒与其转运体减少有关。5.硒代半胱氨酸甲基化转移酶SMT基因在突变体vse2中的表达量较高,推测突变体vse2中硒代半胱氨酸转变为硒代甲基半胱氨酸,减少了硒蛋白的毒性。6.硒胁迫下,突变体vse2中GPX1基因表达和GPX活性上升,说明突变体vse2清除胁迫产生的活性氧能力提高。7.硒胁迫下,当培养基中加入BSO时,突变体vse2对硒的耐受性消失；且突变体vse2中的GSH含量和GSH1基因表达量均升高,说明突变体vse2对硒的耐受性部分依赖GSH途径。8.进一步检测CTK含量和相关基因IPT, TPS25基因的表达量,发现硒胁迫下,CTK含量增加,同时IPT, TPS25基因的表达量上升,推测CTK含量上升,与相关基因IPT, TPS25表达量上升有关。9.耐硒突变体vse2对干旱、甘露醇、低温胁迫敏感。综上所述,TPS22基因介导硒耐受的分子机制可能是：1、硒胁迫下,突变体vse2中磷转运体PHT1；1基因表达量降低,使得进入突变体中的硒较少,减少了过量的硒对植物的伤害。另外,突变体通过高水平的表达SMT和GPX基因,减少错误硒蛋白的插入,增强GPX活性,提高了突变体vse2清除H2O2能力,增加突变体对硒的耐受性。2、TPS22介导的硒耐受部分依赖GSH途径。3、突变体TPSS基因的下调,引起异戊烯基转移酶和萜类合酶相关基因的表达水平增强,使细胞分裂素含量上升,提高了突变体的抗逆能力。另外,TPS22基因下调,使得突变体vse2对干旱、低温、渗透胁迫敏感。
【关键词】：拟南芥 硒耐受性 TPS22基因
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 致谢7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-16
• 第一章 前言16-25
• 1.1 模式植物拟南芥16
• 1.2 正向遗传学途径与化学诱导激活XVE系统16-17
• 1.3 Tail-PCR克隆技术17
• 1.4 萜类合成酶与异戊烯基转移酶17-19
• 1.4.1 萜类合成酶17-18
• 1.4.2 异戊烯基转移酶18-19
• 1.5 植物硒研究进展19-23
• 1.5.1 硒对植物的作用19-21
• 1.5.2 植物对硒的吸收21
• 1.5.3 植物对硒的运输、代谢途径21-22
• 1.5.4 植物对硒耐受的机理22-23
• 1.6 植物抗干旱、低温和渗透胁迫的研究进展23-24
• 1.6.1 植物抗干旱胁迫研究进展23
• 1.6.2 植物抗低温胁迫研究进展23
• 1.6.3 植物抗渗透胁迫研究进展23-24
• 1.7 本研究目的和意义24-25
• 第二章 材料与方法25-43
• 2.1 实验材料25
• 2.2 生化试剂及药品25-28
• 2.2.1 常用分子生物学试剂盒25
• 2.2.2 常用生化试剂25
• 2.2.3 常用溶液与试剂的配制方法和用量25-28
• 2.3 主要实验仪器、设备28
• 2.4 实验方法28-43
• 2.4.1 拟南芥的土壤培养28-29
• 2.4.2 拟南芥的培养皿培养29
• 2.4.3 根长与鲜重的测量29
• 2.4.4 拟南芥组织中Se含量测定29-30
• 2.4.5 拟南芥组织中GPX活性测定30
• 2.4.6 谷胱甘肽(GSH)含量的测定30-31
• 2.4.7 细胞分裂素含量的测定31-32
• 2.4.8 拟南芥DNA的提取(CTAB)方法32-33
• 2.4.9 Tail-PCR法克隆拟南芥耐硒基因33-36
• 2.4.10 Trizol法抽提拟南芥总RNA36
• 2.4.11 RT-PCR和QRT-PCR36-38
• 2.4.12 PCR引物设计38-39
• 2.4.13 拟南芥的杂交39-40
• 2.4.14 脯氨酸含量测定40-41
• 2.4.15 可溶性糖含量测定41-42
• 2.4.16 丙二醛含量测定42
• 2.4.17 实验数据的分析与处理42-43
• 第三章 结果与分析43-64
• 3.1 耐硒突变体vse2的分离43-46
• 3.1.1 突变体vse2的分离43-44
• 3.1.2 土壤培养条件下的WT和突变体vse244-45
• 3.1.3 突变体vse2发芽率分析45-46
• 3.2 VSE2基因克隆46-48
• 3.2.1 Tail-PCR法克隆VSE2基因46-47
• 3.2.2 VSE2基因序列47
• 3.2.3 XVE载体插入位点分析47-48
• 3.3 TPS22基因结构与表达模式分析48-51
• 3.3.1 TPS22基因表达水平分析48-49
• 3.3.2 TPS22基因同源性分析和氨基酸序列比对49-51
• 3.3.4 基因表达模式分析51
• 3.4 TPS22基因调控硒耐受的机理分析51-57
• 3.4.1 突变体vse2的硒吸收转运及代谢分析51-54
• 3.4.3 TPS22基因调控的硒耐受部分依赖GSH途径54-56
• 3.4.4 TPS22基因与细胞分裂素56-57
• 3.5 突变体vse2对其他胁迫的响应57-64
• 3.5.1 突变体vse2对干旱胁迫的响应57-60
• 3.5.2 突变体vse2对低温胁迫的响应60-61
• 3.5.3 突变体vse2对甘露醇胁迫的响应61-64
• 第四章 讨论与展望64-66
• 参考文献66-74
• 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况74

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