CXCR4启动子驱动的双荧光报告基因载体构建与活性观察

发布时间：2017-09-29 23:25

  本文关键词：CXCR4启动子驱动的双荧光报告基因载体构建与活性观察

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【摘要】：趋化因子(chemokines)及其相应趋化因子受体(chemokine receptors)不仅参与了胚胎发育、淋巴细胞的转运、血管生成等生物体内的各种重要的生命活动,并且在免疫性疾病及各种肿瘤中发挥着关键的不可或缺的作用。大量临床研究表明,乳腺癌患者的乳腺组织与健康人正常乳腺组织相比,CXCR4的表达量明显要高,不仅如此,还发现它的相应配体CXCL12在肝、肺、淋巴结、骨髓等这些癌细胞常转移去的靶器官组织中也均高表达,表明癌细胞表达的趋化因子及其转移的靶器官表达的相应趋化因子受体与靶器官特异转移密切相关。然而,目前关于CXCR4的研究特别是基因表达的研究大部分集中在CXCR4日性细胞和阴性细胞的混合细胞,不能完全了解CXCR4单阳性细胞的基因表达情况。因此,本项研究的目的是拟建立一种用来分离CXCR4单阳性细胞的方法,以方便对其基因表达及体内转移行为的研究。本项研究的方法是通过构建一种双荧光蛋白报告基因载体,并以CXCR4基因启动子驱动绿色荧光蛋白,以小鼠组成性启动子驱动参比报告基因红色荧光蛋白,并以此双荧光蛋白报告基因转染小鼠乳腺癌细胞,经荧光检测验证报告基因活性之后,采用流式细胞仪技术分选CXCR4阳性细胞,进而进行体外培养观察CXCR4阳性和阴性细胞的体外生长特性,为进一步开展CXCR4阳性和阴性细胞的体内转移的研究奠定基础。研究结果表明,双荧光蛋白报告基因载体构建成功,体外活性检测表示所构建的双荧光报告基因载体具有活性。以CXCR4特异性启动子驱动的双荧光蛋白也具有活性。以双荧光蛋白报告基因转染的细胞经流式细胞仪分选后获得了CXCR4阳性细胞和阴性细胞,并且经体外细胞培养观察发现,CXCR4 P日性细胞具有细胞延展性弱、细胞伪足较短,贴壁不牢固等生长特性,CXCR4阴性细胞具有细胞延展性强,细胞伪足较长,贴壁牢固的生长特性。体外培养充分证实CXCR4阳性细胞与CXCR4阴性细胞具有明显的生长模式,这为进一步进行体内研究提供了可靠的依据。本项研究结果的意义还在于,利用基因启动子筛选基因表达阴性和阳性的细胞,相比于用特异性抗体筛选的方法,更有利于保持癌细胞原始性和完整性,有利于体外培养生长,并对移植和肿瘤重建不产生影响；本研究构建的双荧光报告基因载体还可用于其他动物基因启动子的替换,分选不同基因表达的阳性细胞,是一种快捷方便的报告基因载体。并且本研究中克隆的两段CXCR4启动子在乳腺癌细胞中均具有足够启动外源基因表达的活性,所以可以利用CXCR4启动子特异性的在癌细胞中启动治疗基因的表达来实现肿瘤基因治疗的靶向性。并且CXCR4上游500bp大小的启动子具有足够的活性并且序列较短,所以能够增加载体携带外源基因的容量。
【关键词】：CXCR4启动子 乳腺癌细胞 双荧光报告基因载体
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-11
• 第一章 前言11-24
• 1.1 趋化因子及其受体简介11-14
• 1.1.1 趋化因子的结构与功能11-12
• 1.1.2 趋化因子受体的结构与功能12-14
• 1.2 趋化因子及其受体对乳腺癌的调节作用14-18
• 1.2.1 趋化因子及其受体对乳腺癌生长的调节14-15
• 1.2.2 趋化因子及其受体对乳腺癌增殖的调节15-16
• 1.2.3 趋化因子及其受体对乳腺癌转移的调节16-17
• 1.2.4 趋化因子及其受体与乳腺癌的预后与治疗17-18
• 1.3 趋化因子受体CXCR4在乳腺癌中的研究现状18-24
• 1.3.1 CXCR4简介18-20
• 1.3.2 CXCR4对乳腺癌的作用20-22
• 1.3.3 CXCR4与乳腺癌的预后与治疗22-24
• 第二章 双荧光报告基因载体的构建24-46
• 2.1 试验材料24-26
• 2.1.1 试验主要化学试剂24
• 2.1.2 试验主要仪器24-25
• 2.1.3 耗材25
• 2.1.4 软件及网络资源25
• 2.1.5 实验相关质粒和引物25-26
• 2.2 试验方法26-35
• 2.2.1 扩增绿色荧光载体EGFP-N1上的CMV启动子26-28
• 2.2.2 去除EGFP-N1多克隆位点的绿色荧光蛋白报告基因载体的构建28-29
• 2.2.3 扩增红色荧光蛋白载体mCherry-N1上的mCherry polyA signal片段29-31
• 2.2.4 含有mCherry polyA signal绿色荧光蛋白报告基因载体的构建31-32
• 2.2.5 扩增pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上的上EFI启动子32-33
• 2.2.6 含有EFI启动子的双荧光蛋白报告基因载体的构建33-34
• 2.2.7 细胞转染34-35
• 2.3 试验结果与分析35-46
• 2.3.1 上下游含有多克隆位点CMV启动子的扩增35-36
• 2.3.2 目的基因和报告基因载体的双酶切36
• 2.3.3 pluspEGFP-N1重组载体的PCR检测及测序36-38
• 2.3.4 mCherry和多聚腺苷酸尾巴的扩增38
• 2.3.5 mCherry polyA和pluspEGFP-N1的双酶切38-39
• 2.3.6 mCherry-pluspEGFP-N1重组载体的PCR检测及测序39-41
• 2.3.7 EFI的扩增41
• 2.3.8 EFI启动子与pmCherry- pluspEGFP-N1的双酶切41-42
• 2.3.9 pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1载体的PCR检验及测序42-44
• 2.3.10 pEF1-pmCherry-pluspEGFP-N1双荧光报告基因载体的构建44-45
• 2.3.11 双荧光蛋白报告载体活性的共聚焦荧光显微镜检测45-46
• 第三章 CXCR4启动子驱动的双荧光报告基因载体构建46-64
• 3.1 试验材料46-47
• 3.1.1 细胞系46
• 3.1.2 试验主要试剂与耗材46
• 3.1.3 试验主要仪器46-47
• 3.1.4 CXCR4启动子引物47
• 3.2 试验方法47-53
• 3.2.1 细胞复苏47
• 3.2.2 细胞传代培养47-48
• 3.2.3 基因组DNA的提取48
• 3.2.4 细胞基因组DNA完整性检测48
• 3.2.5 CXCR4启动子的扩增48-50
• 3.2.6 CXCR4启动子驱动的双荧光报告基因载体构建50-52
• 3.2.7 细胞转染52-53
• 3.2.8 荧光蛋白活性的共聚焦显微镜检测53
• 3.3 试验结果与分析53-64
• 3.3.1 基因组DNA提取结果53-54
• 3.3.2 CXCR4启动子的扩增54-55
• 3.3.3 CXCR4启动子和pEF1-pmCherry- pluspEGFP-N1载体的双酶切55-56
• 3.3.4 CXCR4启动子驱动的双荧光报告基因载体的双酶切检验及测序56-60
• 3.3.5 CXCR4启动子驱动的双荧光蛋白报告载体活性的共聚焦荧光显微镜检测60-61
• 3.3.6 CXCR4启动子转录结合位点分析61-64
• 第四章 CXCR4阳性细胞与CXCR4阴性细胞的分选及体外培养64-69
• 4.1 流式细胞仪分选CXCR4阳性细胞和阴性细胞64-66
• 4.2 细胞的体外观察培养66-67
• 4.3 讨论67-69
• 参考文献69-74
• 附录74-75
• 致谢75

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本文编号：944849