龙眼DlGI和DlFKF1基因的克隆及功能研究

发布时间：2017-10-02 10:28

  本文关键词：龙眼DlGI和DlFKF1基因的克隆及功能研究

  更多相关文章： 龙眼 DlGI基因 DlFKF1基因 激素 开花时间 启动子

【摘要】：龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是重要的亚热带果树。本试验以‘红核子’和‘四季蜜’龙眼为材料,克隆龙眼GIGANTEA (GI)和FLAVIN-BINDING, KELCH REPEAT, F-BOX1(FKFl)基因,初步研究龙眼两个基因的功能,研究结果有助于了解龙眼GI和FKFl的功能以及开花调控的分子机制。本试验主要获得了以下研究结果：1.以‘红核子’龙眼叶芽为试验材料,克隆了龙眼GI和FKFl同源基因cDNA编码区全长序列,命名为DIGI和DlFKFl。荧光定量PCR分析DIGI和DIFKF1在‘红核子’龙眼花芽分化过程中的表达。结果显示,在11月份(龙眼花芽分化生理分化期),DIGI和DIFKF1基因表达量均达到顶峰,在2月份(龙眼花芽分化进入形态分化期),DIGI和DIFKF1的表达量最低。2.将DIGI和DIFKF1构建植物重组表达载体,农杆菌介导转入拟南芥中,对转基因植株表型进行分析发现。在长日照条件下,DIGI和DIFKF1过量表达导致促进转基因拟南芥不定根的形成和早花现象,荧光定量PCR结果表明DIGI和DIFKF1促进拟南芥体内生长素的合成。在短日照条件下,DIGI过量表达拟南芥表现出早花现象,而DIFKF1过量表达使拟南芥表现出晚花现象,同时两种转基因植株都出现下胚轴伸长的现象；同时通过荧光定量PCR对赤霉素合成途径中关键基因在拟南芥根和叶片的表达结合液相色谱数据表明,DIGI拟南芥和DIFKF1拟南芥GA3的激素水平均显著低于野生型,说明短日照下,DIGI和DIFKF1抑制拟南芥体内GA3的合成,同时DlGI有促进开花的功能。结合龙眼花芽分化过程DIGI和DIFKF1在生理分化期表达量上升的现象,推测DIGI和DIFKF1在龙眼中可能通过调节内源激素水平促进花芽分化。3.将构建好的DIGI和DIFKF1基因表达载体转化普通烟草,DIGI和DIFKF1转基因烟草都表现出不定根增加的现象,DIGI烟草的根长显著比对照短,与长日照条件下转基因拟南芥的表型相似,进一步验证了DIGI和DIFKF1能调控激素合成的功能。同时在两个品种的转基因烟草中,都出现了不同时期的生理落花现象。4.以‘红核子’和‘四季蜜’龙眼DNA为材料,分别克隆出DIGI基因1338 bp和1587 bp启动子,序列分析显示,‘红核子’和‘四季蜜’启动子中有22个相同的顺式元件,有10个不同的顺式元件,‘四季蜜’中存在着TCA-element、TGA-element Unnamed-2特有的顺式元件,红核子仅有一个特有的顺式元件MBSI,DIGI在两个龙眼品种中的表达差异可能与启动子的顺式元件差异有关。
【关键词】：龙眼 DlGI基因 DlFKF1基因 激素 开花时间 启动子
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S667.2
【目录】：

• 摘要10-11
• Abstract11-13
• 缩写词13-14
• 第一章 前言14-20
• 1 植物生物钟14-17
• 1.1 拟南芥的生物钟15-16
• 1.2 生物钟与开花调控16-17
• 2 GI的研究进展17-18
• 3 FKF1的研究进展18-19
• 4 本研究的目的和意义19-20
• 第二章 龙眼DlGI和DlFKF1基因的克隆与表达分析20-33
• 1 试验材料20-21
• 1.1 植物材料20
• 1.2 试剂20
• 1.3 感受态细胞和克隆载体20
• 1.4 引物合成及测序20-21
• 1.5 仪器设备21
• 2 试验方法21-23
• 2.1 总RNA的提取及纯化21
• 2.2 cDNA的合成21
• 2.3 引物设计与合成21-22
• 2.4 DlGI和DlFKF1基因片段的PCR扩增22
• 2.5 目的片段的回收22
• 2.6 载体与目的片段的连接22
• 2.7 产物的连接及转化22-23
• 2.8 测序及结果分析23
• 2.9 DlGI和DlFKF1基因的表达分析23
• 3 结果与分析23-31
• 3.1 ‘红核子’龙眼RNA的提取23-24
• 3.2 DlGI和DlFKF1基因的克隆24-30
• 3.3 龙眼DlGI和DlFKF1基因在花芽分化过程的表达30-31
• 4 讨论31-33
• 第三章 龙眼DlGI和DlFKF1基因植物表达载体构建及转化拟南芥33-52
• 1 材料和仪器33-34
• 1.1 材料33
• 1.2 根癌农杆菌感受态细胞及载体33
• 1.3 试剂与试验仪器33
• 1.3.1 试剂33
• 1.3.2 仪器设备33
• 1.4 培养基与培养条件33-34
• 2 试验方法34-35
• 2.1 龙眼DlGI和DlFKF1(带有酶切位点)的克隆34
• 2.2 龙眼DlGI和DlFKF1基因表达载体的构建34-35
• 2.3 DlGI和DlFKF1与表达载体的连接35
• 2.4 DlGI和DlFKF1重组质粒转化大肠杆菌35
• 2.5 DlGI和DlFKF1重组质粒的验证35
• 3 DlGI和DlFKF1重组质粒转化根癌农杆菌35-37
• 3.1 DlGI和DlFKF1重组质粒的提取35-36
• 3.2 根癌农杆菌GV3103的活化及感受态细胞制备36
• 3.3 DlGI和DlFKF1重组质粒转化GV310336
• 3.4 DlGI和DlFKF1重组质粒转化GV3103验证36-37
• 4 根癌农杆菌介导的DlGI和DlFKF1基因转化拟南芥37
• 4.1 拟南芥的播种37
• 4.2 拟南芥的遗传转化37
• 4.3 转基因拟南芥植株的筛选37
• 4.4 拟南芥的移栽37
• 5 转基因拟南芥植株的分子鉴定37-39
• 5.1 转基因拟南芥植株DNA的提取37-38
• 5.2 DNA鉴定38
• 5.3 转基因拟南芥植株RNA的提取38
• 5.4 半定量检测38
• 5.5 荧光定量PCR检测38-39
• 6 转基因拟南芥植株表型的观测和统计39
• 7 短日照下拟南芥转基因植株内源激素含量(GA_3、IAA)的测定39-40
• 7.1 拟南芥内源激素的提取39
• 7.2 拟南芥内源激素含量的测定39-40
• 8 结果与分析40-50
• 8.1 DlGI和DlFKF1基因植物表达载体的构建40-41
• 8.2 pSAKDlGI和pSAKDlFKF1导入根癌农杆菌41-42
• 8.3 转基因拟南芥的筛选42-43
• 8.4 拟南芥转基因植株的分子鉴定43-44
• 8.5 T_3代转基因拟南芥性状观察44-50
• 8.5.1 长日照下转基因拟南芥表型变化44-47
• 8.5.1.1 根部表型差异44-45
• 8.5.1.2 开花时间表型差异45-46
• 8.5.1.3 拟南芥转基因植株根部IAA关键合成酶的表达分析46-47
• 8.5.2 短日照下转基因拟南芥表型变化47-50
• 8.5.2.1 根部表型差异47-48
• 8.5.2.2 开花时间表型差异48-49
• 8.5.2.3 拟南芥转基因植株根部GA_3关键合成酶的表达分析49-50
• 8.5.2.4 拟南芥转基因植株内源激素GA_3水平的测定50
• 9 讨论50-52
• 第四章 龙眼DlGI和DlFKF1基因转化烟草52-58
• 1 材料和仪器52
• 1.1 植物材料52
• 1.2 DlGI和DlFKF1植物表达载体52
• 1.3 试剂与仪器设备52
• 1.4 培养基与培养条件52
• 1.4.1 培养基配方52
• 1.4.2 植物培养条件52
• 2 根癌农杆菌介导的DlGI和DlFKF1基因转化普通烟草52-53
• 2.1 烟草的茎段培养及外植体预培养52-53
• 2.2 烟草外植体的转化53
• 2.2.1 侵染液的制备53
• 2.2.2 侵染53
• 2.3 烟草抗性芽的筛选53
• 2.4 抗性芽的生根培养53
• 2.5 抗性植株炼苗及移栽53
• 3 烟草抗性植株的分子鉴定53-54
• 3.1 烟草抗性植株DNA的提取54
• 3.2 DNA鉴定54
• 3.3 转基因烟草植株主要植物学性状的观测54
• 4 结果与分析54-57
• 4.1 根癌农杆菌介导的DlGI和DlFKF1基因转化普通烟草54
• 4.2 烟草转基因植株的分子鉴定54-55
• 4.3 转基因烟草性状观察55-57
• 4.3.1 转基因烟草的根部生长差异55-56
• 4.3.2 转基因烟草的开花情况56-57
• 5 讨论57-58
• 第五章 龙眼DlGI启动子的克隆58-68
• 1 材料和仪器58
• 1.1 植物材料58
• 1.2 试剂58
• 1.3 感受态和克隆载体58
• 1.4 引物合成及测序58
• 1.5 仪器设备58
• 2 试验方法58-61
• 2.1 ‘红核子’和‘四季蜜’龙眼的DNA提取58-59
• 2.2 物设计与合成59
• 2.3 DlGI基因启动子克隆59-61
• 2.4 DlGI基因启动子全长验证61
• 2.5 目的片段的回收61
• 2.6 载体与目的片段的连接61
• 2.7 产物的连接及转化61
• 2.8 测序及结果分析61
• 3 结果与分析61-66
• 3.1 ‘四季蜜’与‘红核子’龙眼DNA的提取62
• 3.2 DlGI启动子的克隆62-63
• 3.3 ‘红核子’和‘四季蜜’龙眼DlGI启动子序列比较63-66
• 4 讨论66-68
• 第六章 总结与展望68-69
• 参考文献69-76
• 致谢76

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 黄芬娜;龙眼DlGI和DlFKF1基因的克隆及功能研究[D];福建农林大学;2016年

，

本文编号：959121