长武134小麦GAPDH基因过表达载体的构建及拟南芥的遗传转化

发布时间：2016-08-18 12:18

本文关键词：DREB1B基因在转基因小麦后代的稳定表达，由笔耕文化传播整理发布。

《西北农林科技大学》 2014年

张阳璞

【摘要】：小麦(Triticum aestivum)，禾本科小麦属，，是总产量仅次于玉米（Zea mays）的大宗粮食作物，在我国农业生产中占有非常重要的地位。干旱是影响我国北方地区小麦正常生产的一个严重问题，寻找并培育具有一定抗旱能力的农作物新品种是我国农业科学家需要解决的重大课题。GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，三磷酸甘油醛脱氢酶）基因通常被认为是持家基因，几乎在所有组织或细胞中都能高水平表达，故被广泛用作生物组织中基因表达量研究的标准化内参。但近年来研究发现，其在某些组织和部位中表达量并不是稳定不变的。本实验室在以小麦抗旱品种长武134为试验材料的研究中发现该小麦品种的GAPDH蛋白在受到干旱胁迫时其表达量上升，而且与不抗旱的品种相比更高，因此我们认为GAPDH蛋白参与了小麦的抗旱作用。本文同样选取抗旱性较强的小麦品种长武134为材料，提取-1.2MPaPEG6000处理过48h的小麦幼芽的RNA，反转录得到了其cDNA序列，通过PCR克隆得到GAPDH基因，采用传统的酶切连接的方法构建了GAPDH基因的过表达载体pTCK303-GAPDH，并采用农杆菌介导的浸染花序法遗传转化了拟南芥（Arabidopsis thaliana）。实验结果如下：实验中采用Trizol法提取小麦幼芽的总RNA，提取的-1.2MPaPEG6000处理48h的长武134小麦的总RNA完整性较好，反转录成cDNA后，以cDNA为模板进行PCR扩增，构建pTCK303-GAPDH过表达载体，将载体送出测序，测序结果已知序列GAPC（code：EF592180.1）相似度为99.7%，表明载体构建成功。通过在人工气候培养箱的种植过程，确定了拟南芥的培养条件：在光照条件下光照强度8800~13200lx，时间/温度为16h/22℃，黑暗条件下时间/温度为8h/20℃，保持培养箱的湿度70%。完成表达载体构建后，将表达载体转入农杆菌EHA105中，采用农杆菌侵染花序法完成了对拟南芥进行了遗传转化，并收获种子。筛选转基因拟南芥需要确定所采用抗生素的浓度，本文通过两次重复的实验，确定了利用卡那霉素筛选转基因拟南芥的适宜浓度为50mg/L。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q943.2
【目录】：

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