鲟源海豚链球菌的分离鉴定及荚膜多糖基因的进化分析

发布时间：2017-10-06 04:18

  本文关键词：鲟源海豚链球菌的分离鉴定及荚膜多糖基因的进化分析

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【摘要】：2013年8-9月,四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病。为明确其病因,本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行涂片检查和病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测。肝脏和脾脏涂片均观察到大量的革兰氏阳性球菌,从患病鱼体内分离到一株优势菌,革兰氏染色呈G+链状球菌(Ab130920)。人工感染实验证实分离株能够引起试验鱼高死亡率,明确了其病原性。生理生化特性检测,除对精氨酸和乳糖反应外,与海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae) (ATCC29178)基本一致；16S rDNA序列(GenBank登录号：KJ162337)与GenBank中S.iniae 16S rDNA序列同源性最高,在以16S rDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,分离菌与S.iniae聚为一族;同时,在基于S.iniae乳酸氧化酶基因的特异性PCR检测中,从分离株基因组DNA扩增出预期大小的870 bp条带,综合表型特征和分子学特征检测结果,进而鉴定分离菌Ab130920为S.iniae,药物敏感性检测发现其对阿莫西林、强力霉素、氟苯尼考等抗菌药物敏感,但对新生霉素、利福平、氧氟沙星耐药。为研究其毒力,本试验进行了血清杀菌实验、血清学分型、对EPC细胞的粘附和侵染实验、毒力基因检测和自然发病鱼的病理学损伤研究。结果表明,菌株在健康西伯利亚鲟的血清中存活率为66.2%,说明血清仅能够杀死部分细菌,存活细菌可能随着血液循环引起全身性的感染；通过对精氨酸和乳糖反应以及随机扩增多态性DNA标记分析,证实Ab130920为血清学Ⅱ型；其对EPC细胞的粘附率为3.28%,侵入率为0.08%,证明菌株可粘附在宿主细胞表面进而进入细胞内定殖；在对cpsD、simA、sagA、pdi和scpl等5种S. iniae毒力基因的多重PCR检测中,分离菌均扩增出相应大小的特异性片段,表明其为一毒力较强的菌株,与人工感染实验的高致病性结果相佐证;组织病理学表明,Ab130920引起西伯利亚鲟全身性感染,导致多个组织器官的出血、细胞变性和坏死,尤其是肝、肾、脾、心和肌肉的严重损伤,表现为坏死性肝炎、肝血管炎、肾小球肾炎、间质性肾炎、急性脾炎、心肌炎、桑葚心和骨骼肌的坏死性肌炎;另外鳃、胃肠道、脑和胰腺也出现不同程度的损伤,表现鳃小片炎、胃炎、肠炎、脑膜炎和胰腺广泛性出血。为研究其荚膜多糖基因的进化关系,对菌株Ab130920和标准菌株ATCC29178的荚膜多糖基因进行PCR扩增,并克隆测序,获得其序列,并与相关文献和GenBank中荚膜多糖基因进行多序列比对,明确英膜多糖基因的变异性,分析其碱基突变引起相应氨基酸的改变。选择变异性较大的基因cpsD,与相关文献和GenBank中的荚膜多糖基因序列进行贝叶斯进化分析。结果表明,S.iniae荚膜多糖基因存在变异的有cpsY、cpsC、cpsD、cpsE、cpsG和cpsY基因,特别是cpsD和cpsE;变异基因在相应位点发生插入、缺失或移码突变,引起相应氨基酸改变；选择cpsD基因进行贝叶斯进化分析,发现分离的鲟源S.iniae Ab130920变异程度高。
【关键词】：西伯利亚鲟 海豚链球菌 分离鉴定 毒力研究 荚膜多糖 进化分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 文献综述11-25
• 1 鲟鱼的养殖与病害11-13
• 1.1 鲟鱼的生物学特性及养殖状况11
• 1.2 鲟鱼的主要疾病11-13
• 2 S.iniae研究进展13-23
• 2.1 S.iniae的分类及生物学特性13-14
• 2.2 S.iniae的感染及症状14-19
• 2.3 S.iniae致病机制及毒力因子19-22
• 2.4 防治22-23
• 3 实验目的及意义23-25
• 第二章 鲟源S.iniae的分离鉴定25-40
• 1 材料25-26
• 1.1 试验菌株及试验动物25
• 1.2 主要仪器25
• 1.3 主要试剂25-26
• 2 方法26-28
• 2.1 病原检测26
• 2.2 人工感染26-27
• 2.3 菌株鉴定27-28
• 2.4 药物敏感性试验28
• 3 结果28-37
• 3.1 剖解及临床症状观察28-30
• 3.2 病原检测结果30-31
• 3.3 人工感染31-32
• 3.4 菌株鉴定32-34
• 3.5 分子学鉴定34-36
• 3.6 药物敏感性试验36-37
• 4 讨论37-40
• 4.1 Siniae感染现状37-38
• 4.2 Siniae的鉴定38-39
• 4.3 S iniae的药物敏感性39-40
• 第三章 分离株的毒力研究40-55
• 1 材料40-41
• 1.1 试验菌株和试剂40
• 1.2 主要仪器40
• 1.3 主要试剂40-41
• 2 方法41-44
• 2.1 血清杀菌实验41
• 2.2 菌株对EPC细胞的粘附与侵染41-42
• 2.3 菌株血清型分型42-43
• 2.4 菌株主要毒力基因检测43
• 2.5 自然感染西伯利亚鲟的病理损伤研究43-44
• 3 结果44-51
• 3.1 血清杀菌实验44
• 3.2 菌株对EPC细胞的粘附和入侵44-45
• 3.3 血清学分型45
• 3.4 菌株主要毒力基因检测45-46
• 3.5 自然感染S.iniae西伯利亚鲟病理学损伤46-51
• 4 讨论51-55
• 4.1 S.iniae的血清学分型51-52
• 4.2 S.iniae的毒力因子52-53
• 4.3 组织病理学损伤53-55
• 第四章 基于S.iniae荚膜多糖基因的进化分析55-70
• 1 试验材料55
• 1.1 试验菌株/载体55
• 1.2 主要试剂55
• 1.3 主要仪器55
• 2 试验方法55-61
• 2.1 引物设计与合成55-56
• 2.2 S.iniae荚膜多糖cps基因的PCR扩增56-57
• 2.3 荚膜多糖基因的T载体克隆57-58
• 2.4 S.iniae cps基因多样性分析58
• 2.5 cpsD基因的贝叶斯进化分析58-61
• 3 结果61-66
• 3.1 荚膜多糖cps基因PCR扩增61-62
• 3.2 cps基因多样性分析62-63
• 3.3 荚膜多糖基因突变及其编码氨基酸变异分析63-65
• 3.4 基于cpsD基因贝叶斯进化分析65-66
• 4 讨论66-69
• 4.1 S.iniae cps基因多样性66-68
• 4.2 cpsD基因的进化分析68-69
• 5 结论69-70
• 参考文献70-77
• 作者攻读硕士学位期间发表的学术论文77-78
• 致谢78

【参考文献】

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1 祝t熈，

本文编号：980674