外源香蕉枯萎病菌基因小分子RNA对其生长发育的影响

发布时间：2017-10-07 03:06

  本文关键词：外源香蕉枯萎病菌基因小分子RNA对其生长发育的影响

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【摘要】：香蕉枯萎病危害着我国和世界香蕉产业的健康发展,是亟待解决的世界性难题。寄主植物诱导基因沉默技术是培育广谱和持久抗病性的香蕉新种质的有效途径之一。前期通过对香蕉枯萎病菌早期发育蛋白质组和24种营养亲和型病原菌基因组的深入分析,发现麦角甾醇生物合成途径Fo ERG6、Fo ERG11、Fo ERG13和Fo ERG25蛋白对病原菌的生长发育至关重要,是极佳的防控靶标位点。其中Fo ERG6蛋白有两个同源基因编码即Fo ERG6A、Fo ERG6B,Fo ERG11蛋白有三个同源基因编码即Fo ERG11A、Fo ERG11B、Fo ERG11C,Fo ERG13蛋白有三个同源基因编码即Fo ERG13A、Fo ERG13B、Fo ERG13C,Fo ERG25蛋白有三个同源基因编码即Fo ERG25A、Fo ERG25B、Fo ERG25C。本研究主要通过从体外外饲靶标基因小分子RNA处理香蕉枯萎病菌热带四号生理小种(Foc TR4)和一号生理小种(Foc Race1),探索其抑菌效果及相关分子机理,为香蕉抗病分子育种提供理论依据。获得如下结果:1.成功构建了分别表达Foc TR4 ERG6、ERG11、ERG13和ERG25双链RNA(ds RNA)的原核表达载体和香蕉遗传转化表达载体均以“正向片段+内含子+反向片段的”的形式,将四个靶标基因的特异干涉片段构建了由prrn强启动子驱动、能在大肠杆菌HT115(RNase III缺失体)中表达完整ds RNA的载体DI-T-P中;以及由Ubi强启动子驱动,适合在香蕉中表达ds RNA的载体p YL-RNAi中。通过定量PCR检测了阳性菌株中上述基因ds RNA的表达量;通过寄主植物诱导基因沉默技术,获得了含有Fo ERG6和Fo ERG11干涉片段的转基因香蕉植株(由博士生窦同心完成)。2.四个靶标蛋白编码基因的ds RNA对Foc TR4和Foc Race1病原菌的早期发育都有显著的抑制效果提取含靶标基因ds RNA的阳性菌株总RNA,在体外对Foc TR4和Foc Race1进行外饲处理,加入总RNA的浓度为500 ug/ul,孢子处理浓度为1×105 conidia/ml,分别在12、24和48小时时间点取样观察,发现四个靶标基因的ds RNA对Foc TR4和Foc Race1早期发育均表现出显著的抑制作用,其中Fo ERG11和Fo ERG25ds RNA的抑菌作用优于Fo ERG6和Fo ERG13,并说明靶标蛋白编码基因序列在香蕉枯萎病菌中高度保守。3.经靶标基因ds RNA处理后Foc TR4中相应的靶标基因、麦角甾醇和胆固醇生物合成途径相关基因的表达谱变化Foc TR4经靶标基因ds RNA处理0和12小时后,运用定量PCR对靶标基因、麦角甾醇和胆固醇生物合成途径相关基因的表达量进行了分析。发现自身基因都显著下调,其他麦角甾醇途径中的基因即ERG3A、ERG3B、ERG4、ERG6A、ERG6B、ERG11A、ERG11B、ERG11C、ERG13、ERG11A、ERG11B、ERG11C和ERG25均显著下调表达,胆固醇合成途径中的基因即TGL、ARE1A和ARE1B均显著上调表达。说明外饲靶标蛋白编码基因的ds RNA,都能有效抑制四个蛋白编码的靶标基因的表达,同时也影响到了麦角甾醇生物合成途径中其它基因和胆固醇合成途径相关基因的表达。4.高通量测序分析转基因香蕉植株中小分子RNA的表达课题组其他成员运用寄主植物诱导基因沉默技术,就是让香蕉表达ds RNA来沉默入侵病菌细胞内的靶标基因,以达到干扰病菌麦角甾醇生物合成、破坏其生物膜功能的目的。首先获得了对香蕉枯萎病有一定广谱抗性的新种质RNAiFo ERG6和RNAi-Fo ERG11。本研究选择野生型和四个不同转基因株系(RNAi-ERG6-8、RNAi-ERG6-36、RNAi-ERG11-43、RNAi-ERG11-52)进行小分子RNA测序分析,靶标基因小分子RNA(si RNAs)的表达量占香蕉总量的1.96%、2.02%、5.47%和6.20%。此外,外饲含靶标基因si RNA的转基因香蕉汁液,也能有效抑制Foc TR4的早期发育。说明在转基因香蕉异源表达枯萎病菌Foc TR4 Fo ERG6和Fo ERG11基因的si RNAs能显著提高它们的抗病性。综上所述,本研究证明Foc TR4的ERGs基因序列在香蕉枯萎病菌小种间非常保守;Foc TR4能够吸收外饲的完整ds RNA和si RNA,并引发体内的RNAi沉默机制;再次说明抑制香蕉枯萎病菌麦角甾醇生物合成途径,干扰其生物膜功能,能有效抑制病原菌的生长。由于ERGs基因在香蕉枯萎病菌中高度保守,且为真菌特有代谢途径的合成基因,寄主植物诱导基因沉默方法靶标ERGs基因在香蕉抗病育种中具有很强的广谱性和安全性。此结果为培育广谱、持久抗病香蕉新种质、解决生产实践中抗病基因资源缺乏的问题开拓了新的策略。
【关键词】：香蕉 Foc TR4 麦角甾醇 转录后基因沉默 dsRNA
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.68
【目录】：

• 摘要3-5
• abstract5-8
• 缩略词与英汉对照8-13
• 1 前言13-21
• 1.1 香蕉与香蕉枯萎病13
• 1.2 香蕉枯萎病的危害13-14
• 1.3 香蕉枯萎病的防治14-15
• 1.4 真菌麦角甾醇的生物合成途径及本研究中相关目的基因15-19
• 1.4.1 本研究中相关目的基因的选择18-19
• 1.5 基于高通量测序的香蕉小分子RNA分析19-20
• 1.6 研究目的及意义20-21
• 2 材料与方法21-39
• 2.1 实验材料21
• 2.2 菌株与载体21-22
• 2.3 PCR扩增引物22-24
• 2.4 主要仪器设备24
• 2.5 主要试剂、药品24-25
• 2.6 主要溶液及试剂配方25-26
• 2.6.1 1000×木村B营养母液25
• 2.6.2 细菌培养基25
• 2.6.3 Foc TR4培养基及培养基组成成分25
• 2.6.4 抗生素贮存液25-26
• 2.6.5 RNA抽提所需试剂26
• 2.7 生物信息学分析工具26
• 2.8 载体的构建及转化26-29
• 2.8.1 目的片段的扩增26-27
• 2.8.2 目的片段的连接27
• 2.8.3 大肠杆菌热激感受态细胞的制备27-28
• 2.8.4 热激法转化大肠杆菌28
• 2.8.5 质粒提取及阳性质粒鉴定28
• 2.8.6 阳性克隆的序列测定与分析28
• 2.8.7 相关载体的构建及转化28-29
• 2.8.8 农杆菌感受态细胞的制备和冻融转化29
• 2.8.9 农杆菌转化子稳定性鉴定29
• 2.9 ds RNA的表达29-30
• 2.10 总RNA的提取30-31
• 2.10.1 Triol法大量提取大肠杆菌总RNA30
• 2.10.2 总RNA中基因组DNA的去除30-31
• 2.11 相关阳性菌株中m RNA的相对表达量31-32
• 2.11.1 反转录c DNA第一条链的合成31
• 2.11.2 大肠杆菌中四个靶基因编码蛋白m RNA的相对表达量31-32
• 2.12 在体外靶标蛋白编码基因的ds RNA对病原菌的抑菌试验32-33
• 2.12.1 病原菌Foc TR4及Foc Race 1 的培养分生孢子的获得32
• 2.12.2 抑菌试验处理方法32
• 2.12.3 抑菌试验处理设计32
• 2.12.4 观察方法32-33
• 2.13 麦角甾醇及胆固醇代谢途径中相关基因的m RNA水平的表达分析33-34
• 2.13.1 Foc TR4菌体的获得33
• 2.13.2 Foc TR4 m RNA的提取及反转录成c DNA33
• 2.13.3 m RNA反转录成c DNA33
• 2.13.4 荧光定量PCR检测相关基因的表达。33-34
• 2.14 转基因香蕉小分子RNA的测序分析34-37
• 2.14.1 RNAi-Fo ERG6和RNAi-Fo ERG11转基因香蕉材料的检测34-35
• 2.14.2 测序转基因香蕉小分子RNA材料的获得35
• 2.14.3 小分子RNA的高通量测序35-37
• 2.14.4 生物信息学分析测序结果37
• 2.15 Foc TR4对转基因香蕉中靶基因si RNA吸收的效果检测37-38
• 2.15.1 香蕉叶片汁液的提取37-38
• 2.15.2 体外液体抑菌试验38
• 2.15.3 拍照处理38
• 2.16 数据处理与分析38-39
• 3 结果与分析39-62
• 3.1 香蕉枯萎病菌中四个靶标蛋白编码基因的生物信息学分析39
• 3.1.1 四个靶标蛋白编码干涉片段的选取39
• 3.2 相关载体的构建39-43
• 3.2.1 香蕉遗传转化表达载体的构建39-41
• 3.2.2 组成型原核表达载体的构建41-43
• 3.3 大肠杆菌HT115菌株中四个靶标蛋白编码基因的ds RNA水平检测43-44
• 3.4 Foc TR4及Foc race1早期发育的抑菌试验44-48
• 3.4.1 四个基因的ds RNA处理Foc TR4的结果展示44-46
• 3.4.2 四个靶标蛋白编码基因的ds RNA处理Foc Race 146-48
• 3.5 麦角甾醇及胆固醇代谢途径中相关基因的m RNA水平的表达分析48-53
• 3.6 转基因香蕉中小分子RNA测序53-58
• 3.6.1 转基因转基因香蕉材料的检测53
• 3.6.2 测序材料的获得及Foc TR4侵染根后的表型53-54
• 3.6.3 小分子RNA测序分析54-58
• 3.7 Foc TR4对转基因香蕉中靶基因si RNA吸收的效果检测58-62
• 4 讨论62-66
• 4.1 抑菌试验及麦角甾醇生物合成途径中相关基因分析62-64
• 4.2 小分子RNA在植物生长发育中的重要性64
• 4.3 宿主诱导的基因沉默64-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-72

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本文编号：986533