葡萄糖氧化酶GOX在棉铃虫与烟青虫下唇腺差异表达的机理初探

发布时间：2017-10-12 20:40

  本文关键词：葡萄糖氧化酶GOX在棉铃虫与烟青虫下唇腺差异表达的机理初探

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【摘要】：同属鳞翅目、夜蛾科、铃夜蛾属的棉铃虫Helicoverpa armigera和烟青虫H.assulta是两个近缘种,但是二者取食的寄主范围却存在很大差异。棉铃虫是典型的多食性昆虫,可以取食30多个科200多种植物;而烟青虫是寡食性昆虫,只能取食茄科的少数植物,如烟草和辣椒等。为了深入揭示植食性昆虫食性差异的内在机理,本文选取二近缘种棉铃虫和烟青虫为研究材料,以在植食性昆虫与寄主互作中发挥重要作用的昆虫下唇腺葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOX)为研究对象,比较了二近缘种GOX在转录和蛋白水平的表达差异,并对其进行分析和探究,取得以下结果。一、棉铃虫与烟青虫下唇腺转录组数据分析转录组RNA-seq为深度揭示基因组规模的转录模式提供了极大的便利。为了从宏观的角度比较多食性的棉铃虫与寡食性烟青虫在食性上的巨大差异,首先对二近缘种的下唇腺进行转录组测序,对其转录水平表达进行系统比较,并以棉铃虫和烟青虫末龄幼虫下唇腺转录组数据为背景,锁定了目标基因GOX。结果表明棉铃虫和烟青虫GOX基因的RPKM值分别是5020.8和4503.5。二者转录水平差异不显著。二、二近缘种GOX活性的动态变化棉铃虫下唇腺由四部分组成,分别是吐丝部、前部、中部及后部,属N型。幼虫期随虫龄的增大,下唇腺随之发育变大。与之相应,GOX活性在不同虫龄甚至是同一虫龄的不同时期亦发生相应的变化。为了明确棉铃虫和烟青虫末龄幼虫在不同时期的GOX活性变化,从蜕皮进入末龄开始,每隔12 h为一个时间点,一直到蜕皮后72 h,分别测定了其GOX活性的变化,以及同期幼虫相对生长率。结果表明:棉铃虫和烟青虫一样,均是在脱皮后12 h GOX活性达到最高值,此时,棉铃虫的酶活是烟青虫的7.3倍,差异达极显著(p0.01)。棉铃虫在48 h以后,GOX活性开始下降,而烟青虫却是在60 h以后。二者均在蜕皮进入末龄幼虫初始和预蛹时活性最低。与此同时,在GOX活性最高时,二者的相对生长率最大,也即取食最活跃的时期。由此可见,GOX活性与昆虫的取食密切相关。三、食物因子对二近缘种下唇腺GOX基因转录水平的调控不同昆虫的GOX活性存在极大差异,鉴于GOX与食性的密切关系,分别让二近缘种取食不同食物,比较不同食物刺激下,如寄主植物,不同营养物质(p:c),或植物毒素对GOX基因转录水平的变化,并与下文中GOX活性的变化相对应,探索引起GOX变化的主要因素,明确它的变化是转录水平上的调控还是翻译或翻译后的调控。结果表明:取食不同寄主植物后,多食性的棉铃虫GOX基因会被其不适宜寄主辣椒诱导而高表达,达显著水平。而对寡食性的烟青虫而言,无论是棉花、烟草还是辣椒都显著诱导GOX基因的高表达。在取食了不同蛋白质和糖比例(p:c)的人工饲料后,棉铃虫的GOX基因表达量仅在50 p:50c时与对照存在显著差异;而烟青虫的却总是随着糖浓度的升高而升高,且在糖浓度最高时与对照存在显著差异。在取食添加了不同植物毒素的人工饲料后,棉铃虫GOX基因无明显的变化;而烟青虫在取食添加了黄酮、十三烷酮、花椒毒素和香豆素的饲料后,其GOX基因被诱导高表达,且显著高于对照。由此表明,寡食性烟青虫的GOX基因对不同寄主植物、营养物质和毒素的敏感性要高于多食性棉铃虫。四、食物因子对二近缘种GOX活性的影响在明确了食物因子对二近缘种GOX基因转录水平调控的基础上,进一步,研究其对二近缘种GOX活性的影响。研究表明:三种植物对两个物种GOX的影响有所不同,但是都表现为取食相对不适宜的寄主植物具有较高的活性。已有的研究尚未就植物中营养物质和植物毒素对GOX的影响进行揭示。尽管不同蛋白质和糖比例(p:c)的饲料对两种昆虫的GOX活性没有显著影响,但是可以看出棉铃虫的GOX活性是随着糖浓度的升高而升高的。进一步,比较了两物种取食分别添加12种植物毒素的人工饲料后的GOX活性变化。结果表明,二近缘种表现出了不同的反应,烟青虫对黄酮、香豆素和花椒毒素的敏感性要高于棉铃虫,对棉酚和烟碱有更好的耐受性。在所有的试验中,多食性的棉铃虫的活性都要显著高于寡食性的烟青虫。在应对植物次生代谢物质的策略上,棉铃虫的GOX可能是作为一种组成型的蛋白存在,而烟青虫的可能是一种诱导性蛋白,究竟这是一种怎样的调节机制,仍需做进一步的研究。
【关键词】：葡萄糖氧化酶GOX 下唇腺 近缘种 动态变化 转录 酶活性 寄主植物 营养物质 植物毒素
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433
【目录】：

• 致谢4-8
• 摘要8-10
• 1 文献综述10-18
• 1.1 植食性昆虫下唇腺葡萄糖氧化酶的基本特性10-14
• 1.1.1 GOX在昆虫中的分布10-12
• 1.1.2 GOX的理化特性12-13
• 1.1.3 昆虫不同发育阶段GOX活性的变化13
• 1.1.4 GOX在昆虫各个组织中的分布13-14
• 1.2 GOX与植物防御之间的关系14-15
• 1.2.1 GOX抑制寄主植物防御性物质的含量14
• 1.2.2 GOX诱导寄主植物的直接性防御和间接性防御14-15
• 1.3 不同寄主植物和食物因子对GOX的影响15-18
• 1.3.1 不同的寄主植物对GOX的影响15-16
• 1.3.2 营养物质中糖与蛋白质对GOX的影响16-17
• 1.3.3 植物毒素与昆虫幼虫下唇腺GOX的关系17-18
• 2 引言18-20
• 2.1 研究背景18-19
• 2.2 目的与意义19-20
• 3 棉铃虫与烟青虫幼虫下唇腺转录组比较20-23
• 3.1 材料与方法20-21
• 3.1.1 供试昆虫20
• 3.1.2 下唇腺的收集及RNA的提取20
• 3.1.3 数据组装20
• 3.1.4 Rpeat Masking20-21
• 3.1.5 数据过滤21
• 3.1.6 序列比对21
• 3.2 结果与分析21-23
• 3.2.1 数据过滤结果21-22
• 3.2.2 Ortholog Pair识别22
• 3.2.3 表达量计算22-23
• 4 二近缘种GOX活性动态变化23-29
• 4.1 材料与方法23-25
• 4.1.1 供试昆虫23
• 4.1.2 酶与试剂23
• 4.1.3 幼虫相对生长率23
• 4.1.4 下唇腺提取物的收集23
• 4.1.5 GOX酶活性的测定23-24
• 4.1.6 溶液与凝胶的配制24-25
• 4.1.7 统计分析25
• 4.2 结果与分析25-29
• 4.2.1 棉铃虫下唇腺显微形态25-27
• 4.2.2 二近缘种末龄幼虫GOX活性的动态变化27-28
• 4.2.3 二近缘种末龄幼虫的相对生长率28-29
• 5 食物因子对二近缘种下唇腺GOX基因转录水平表达的影响29-34
• 5.1 材料与方法29-31
• 5.1.1 供试昆虫与植物29
• 5.1.2 不同食物对昆虫的处理29
• 5.1.3 下唇腺提取物的收集及RNA的提取29
• 5.1.4 cDNA的获取29-30
• 5.1.5 实时荧光定量PCR分析30
• 5.1.6 统计分析30-31
• 5.2 结果与分析31-34
• 5.2.1 寄主植物对二近缘种GOX基因的转录水平的影响31-32
• 5.2.2 不同蛋白质与糖比例对二近缘种GOX基因转录水平的影响32-33
• 5.2.3 植物毒素对二近缘种GOX基因转录水平的影响33-34
• 6 食物因子对二近缘种下唇腺GOX酶活性的影响34-38
• 6.1 材料与方法34
• 6.1.1 供试昆虫与植物34
• 6.1.2 酶和试剂34
• 6.1.3 食料与昆虫的不同处理34
• 6.1.4 下唇腺提取物的收集34
• 6.1.5 GOX活性的测定34
• 6.1.6 溶液和凝胶的配制34
• 6.1.7 统计分析34
• 6.2 结果与分析34-38
• 6.2.1 取食不同植物对GOX活性的影响34-35
• 6.2.2 不同比例的蛋白质和糖（p:c）处理后幼虫下唇腺GOX活性的变化35-37
• 6.2.3 毒素处理对GOX活性的影响37-38
• 7 结论与讨论38-42
• 7.1 棉铃虫与烟青虫幼虫下唇腺转录组分析38
• 7.2 二近缘种GOX活性的动态变化基本一致38
• 7.3 食物因子对二近缘种下唇腺GOX基因转录水平表达的影响不同38-39
• 7.3.1 非适宜性寄主诱导棉铃虫GOX基因的高表达38-39
• 7.3.2 蛋白质和糖均能影响二近缘种GOX基因的表达39
• 7.3.3 烟青虫应对植物毒素的策略属诱导型39
• 7.4 食物因子对于二近缘种下唇腺GOX酶活性的影响不同39-42
• 7.4.1 取食不同的寄主植物对GOX活性的诱导39
• 7.4.2 棉铃虫GOX酶活性随着糖浓度的增加而增加39-40
• 7.4.3 植物毒素处理对GOX活性的影响不同40-42
• 参考文献42-47
• ABSTRACT47-49

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