苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克

发布时间：2017-10-13 11:12

  本文关键词：苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表达及特性研究

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【摘要】：【目的】从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca体内克隆葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOX)基因cDNA序列,并进行原核表达及活性测定。同时对GOX在不同组织的特异表达及对葡萄糖诱导反应的特性进行研究。【方法】以苜蓿夜蛾为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术,扩增苜蓿夜蛾GOX基因全长cDNA序列。利用原核表达载体p ET-21b在大肠杆菌中表达苜蓿夜蛾的GOX基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化,再利用梯度透析法进行复性,以葡萄糖为底物进行酶的活性测定。同时利用Real-time PCR分析GOX的组织特异性表达和对葡萄糖的诱导反应。【结果】该cDNA序列有2 154个碱基,开放阅读框1 824个碱基,编码607个氨基酸组成的多肽,分子量为67.04 ku,多肽的等电点为5.13。该序列命名为Hv GOX,在Gen Bank的登录号为KT907054。序列分析表明,Hv GOX的氨基酸序列与其他昆虫的GOX氨基酸序列高度同源。该基因在大肠杆菌表达系统中成功地进行了诱导表达,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。由原核表达载体表达后的蛋白经过变性、纯化和复性后有活性。Real-time PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾的不同组织均有m RNA水平的特异表达,其中在唾腺中的表达量最高;同时用0.01%、0.1%、1%和10%葡萄糖溶液浸泡的大豆叶喂食的幼虫,幼虫体内的GOX的表达均被诱导,且在10%的浓度时诱导表达量最高。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得一个新的葡萄糖氧化酶基因,该结果为进一步研究葡萄糖氧化酶在昆虫体内的生物功能奠定基础。
【作者单位】： 东北农业大学农学院;
【关键词】： 苜蓿夜蛾 葡萄糖氧化酶 克隆 表达 酶活性
【基金】：国家自然科学基金项目(31201548) 山西省自然科学基金项目(2013011028-3)
【分类号】：S433.4
【正文快照】： 葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOX),是氧化还原型酶(EC1.1.3.4),它能够专一地识别β-D-葡萄糖并将其氧化分解成葡萄糖酸内酯和过氧化氢,而葡萄糖酸内酯会进一步转化成葡萄糖酸,过氧化氢则最终会转变成水和氧气(Ramzanand Mehmood,2009)。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的分解机制存

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1 慕卫,吴孔明,梁革梅,张文吉;苜蓿夜蛾人工饲养技术[J];农药学学报;2002年01期

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本文编号：1024519