蝶蛹金小蜂两个蛋白酶抑制剂的基因克隆与表达模式分析

发布时间：2018-02-13 11:26

本文关键词： 蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆表达模式　出处：《浙江大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：寄生蜂是重要的农业害虫天敌,在生物防治中发挥着相当重要的作用,寄生蜂在产卵过程中,伴随有将毒液、多分DNA病毒、类病毒颗粒等寄生因子一并注入寄主体内,通过调控寄主免疫反应和寄主的生长发育,以确保其后代能够在寄主体内正常发育。蝶蛹金小蜂(Pteromalus puparum)是十字花科蔬菜害虫菜粉蝶蛹期优势内寄生蜂,其仅含有毒液一种寄生因子。目前对蝶蛹金小蜂毒液蛋白已经鉴定明确60个蛋白组分,并分为蛋白酶类、蛋白酶抑制剂、识别或结合蛋白、其他及功能未知蛋白五大类(王磊,2012),本论文主要研究蝶蛹金小蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSPN4和PpSPN6的基因克隆与表达模式。1.蝶蛹金小蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSPN4的基因克隆与表达模式分析通过3’和5’RACE克隆得到蝶蛹金小蜂的PpSPN4的cDNA全长。PpSPN4的cDNA序列全长2623bp,开放式阅读框(ORF)长1923bp,共编码641个氨基酸,预测分子量为72.3kDa,通过SignalP分析,前23个氨基酸为信号肽。将去信号肽的PpSPN4的氨基酸全序列与其他物种中的serpin序列进行同源性比较,构建系统进化树,结果表明,PpSPN4和丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)的serpin4(XM_001603896.2)相似性最高。构建的原核表达载体pET28a-PpSPN4并在自动诱导培养基的诱导下进行表达,SDS-PAGE结果显示pET28a-PpSPN4能在大肠杆菌中大量表达。通过对PpSPN4在蝶蛹金小蜂头、胸、腹(不包括毒囊毒腺和卵巢)、卵巢、毒囊毒腺各组织中的表达情况进行实时荧光定量PCR与Western blot分析,明确该基因在毒囊毒腺中高表达。对蝶蛹金小蜂雌蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSPN4进行时间表达分布分析。Western blot结果表明PpSPN4在不同时期毒液中都有表达,在羽化后6天内,蛋白含量出现了两个高峰期,分别为羽化后第4天与羽化后第6天；定量PCR结果表明,该基因在羽化第1天和羽化后第5天分别出现两次转录高峰期。 2.蝶蛹金小蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSPN6的基因克隆与表达模式分析结合RACE技术与本地BLAST分析,克隆获得蝶蛹金小蜂的PpSPN6的cDNA全长。PpSPN6的cDNA全长1806bp,ORF长1197bp,共编码399个氨基酸,前19个氨基酸为信号肽,预测分子量为44.1kDa。将去信号肽的PpSPN6的氨基酸全序列与其他物种中的serpin序列进行同源性比较,构建系统进化树,分析知PpSPN6和丽蝇蛹集金小蜂的serpin3/4(XP_008201843.1)、alaserpin (XP_008201838.1)相似性最高。构建的原核表达载体pET28a-PpSPN6并在自动诱导培养基的诱导下,SDS-PAGE结果显示pET28a-PpSPN6能在大肠杆菌中大量表达。对蝶蛹金小蜂雌蜂头、胸、腹(不包括毒囊毒腺和卵巢)、卵巢、毒囊毒腺各组织中该基因的表达情况进行半定量PCR和Western blot分析,基因PpSPN6雌蜂毒囊毒腺中高表达。利用Western blot和半定量PCR对PpSPN6在不同时期蝶蛹金小蜂雌蜂毒液中的表达与转录情况进行分析,结果表明,PpSPN6表达量在羽化后前4天保持递增,在第5天表达量减少,到羽化后第6天蛋白表达量再次增加；PpSPN6基因在雌蜂羽化后0-6天均保持较高的转录水平,该蛋白在羽化后第2天、第3天、第5天和第6天出现了相对较高的表达水平。
[Abstract]:This paper mainly studies the gene cloning and expression pattern of the serine protease inhibitor PpSPN4 and PpSPN6 . The cDNA sequence of PpSPN4 was 2623bp , the length of open reading frame ( ORF ) was 1923bp . 2 . Cloning and Expression Pattern Analysis of PpSPN6 from the Serine Protease Inhibitor of the Butterfly Pupa The expression of PpSPN6 was 1806bp . The results showed that the expression of PpSPN6 was 1806bp . The expression of PpSPN6 and serpin 3 / 4 ( XP _ 8201843.1 ) and ppSPN6 were analyzed by Western blot and Western blot . The expression of PpSPN6 was higher than that in other species .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.3

【参考文献】