灰飞虱体内AGO家族的鉴定及其表达分析

发布时间：2018-02-23 00:59

本文关键词： 灰飞虱 RNA干扰 AGO亚家族 PIWI亚家族 qRT-PCR　出处：《浙江师范大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：Argonaute蛋白是RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)中的核心组分,通过与非编码小RNA (micRNA, siRNA, piRNA)结合而发挥重要作用,在真核生物中分为AGO亚家族和PIWI亚家族。AGO亚家族广泛分布在多种组织器官中,通过结合由RNase Ⅲ核酸内切酶加工处理得到的siRNA、 miRNA参与到siRNA和miRNA途径而发挥作用；PIWI亚家族通过结合piRNA在动物生殖细胞发育和配子生成过程中发挥重要作用。虽然一些昆虫中的AGO家族基因早已明确,如褐飞虱(Nilaparvata lugens),家蚕(Bombyx mori),斯氏按蚊(Anopheles stephensi),但大部分昆虫的AGO蛋白还尚不清楚。灰飞虱(Laodelphax striatellus)是一种普遍存在的经济害虫,属于飞虱科、半翅目,主要传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)口水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV),对我国的农业生产造成严重危害。本研究通过生物信息学、RACE等技术,对灰飞虱AGO亚家族和PIWI亚家族成员进行了鉴定、克隆,并对其在不同发育阶段及不同条件下的情况进行了分析研究。1.灰飞虱中AGO家族蛋白的鉴定与克隆通过将灰飞虱的转录组与褐飞虱、果蝇、家蚕的AGO蛋白序列进行比对分析,得到灰飞虱AGO亚家族(AGO1, AGO2)和PIWI亚家族(PIWI, AGO3)的EST序列。采用5'RACE和3'RACE技术克隆得到了这四个亚家族成员的ORF序列,分析表明,灰飞虱AGO1的ORF核苷酸序列全长2,820 bp,编码939个氨基酸残基；灰飞虱AG02的ORF核昔酸全长2,490 bp,编码829个氨基酸残基；灰飞虱PIWI的ORF核苷酸全长2,508 bp,编码835个氨基酸残基；灰飞虱AG03的ORF核苷酸全长2,688 bp,编码895个氨基酸残基。在灰飞虱的AGO和PIWI亚家族中都发现了预期的保守PAZ和PIWI功能域,且PIWI功能域中都含有DDH催化活性位点。将灰飞虱AGO1、AGO2、PIWI、AGO3的PIWI功能域与其它种昆虫的PIWI功能域进行系统进化分析,结果表明AGO和PIWI亚家族分别聚类成两个不同的分枝。2.不同环境压力和不同发育阶段,灰飞虱AGO家族的表达谱分析为了对AGO和PIWI亚家族的潜在功能进行初步研究,本研究在转录水平上对灰飞虱不同发育阶段和不同环境压力下AGO1、AGO2、PIWI和AG03的mRNA表达谱进行了分析。这四种AGO蛋白在各个发育阶段都有表达,AGO1和AG02的mRNA表达量在卵中最高,其次是成虫、高龄若虫、低龄若虫,表明AGO亚家族蛋白可能在卵母细胞的成熟和发育过程中发挥重要作用；PIWI和AG03的mRNA表达量在雄性灰飞虱中高于雌性灰飞虱,表明PIWI亚家族蛋白可能对雄性生殖细胞及精子的发生起着更重要的作用。有趣的是,当灰飞虱成虫感染RBSDV以后,AGO1和AG02的表达都呈现出明显的下调趋势,推测灰飞虱的成虫期可能是RBSDV侵染的后期阶段,灰飞虱细胞中的抗病毒机制在此阶段可能对RBSDV的病毒量有较显著的抑制作用。高低温及转移寄主后,灰飞虱体内AGO表达下调,表明AGO和PIWI亚家族可能参与适应环境压力的生物调控。3.灰飞虱AGO亚家族成员AGO1和AG02的多克隆抗体制备通过抗原设计及基因序列合成制备多克隆抗体的免疫原,免疫家兔后,采用硫酸铵沉淀和Protein A柱层析分离纯化所获得的抗体,最后经ELISA和Western blot检测后得到高效的AGO抗体。本研究首次克隆和分析了灰飞虱的AGO亚家族和PIWI亚家族,对不同环境压力及不同发育阶段的表达谱分析结果表明sRNA介导的RNAi途径参与到了这些调控过程中,这为以后进一步探索灰飞虱AGO的具体功能提供了重要线索。另外,制备的灰飞虱AGO1和AG02多克隆抗体有助于后续进一步深入研究灰飞虱中RNAi为基础的抗病毒机制。
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【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.3

【参考文献】