大丽轮枝菌插入突变体库的构建及分析

发布时间：2018-02-27 19:02

  本文关键词： 大丽轮枝菌 ATMT 突变体库 表型筛选分析 致病相关基因　出处：《西北农林科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在世界范围内,由土壤传播的病原体造成的植物维管束萎蔫病害是最具破坏性的植物病害。大丽轮枝菌是引起植物萎蔫病害的主要病原真菌,可侵染为害400多种植物,其中包括许多具有经济价值的作物。在中国,超过200万公顷的棉花受到大丽轮枝菌的侵染,导致产量下降10-15%。本研究主要围绕大丽轮枝菌展开。首先,我们用能够侵染棉花的大丽轮枝菌落叶型菌株创立并优化了ATMT转化体系。用两种农杆菌菌株(AGL1和EHA105)转化含有潮霉素筛选抗性的双元载体pTC-Hyg到大丽轮枝菌XJ2008菌株中,并在优化的条件下共培养以完成ATMT转化过程。结果表明,在最优条件下转化效率可达100个转化子/106个分生孢子。优化后的ATMT转化体系：取100μl新鲜的分生孢子悬浮液(106个分生孢子/ml)和农杆菌菌液(0D600=0.8)等体积混合,涂布于铺有玻璃纸的IM培养基(含有200μMAS)上。25℃条件下36h后,将玻璃纸转至含有终浓度为200μg/ml头孢霉素和50μg/ml潮霉素B的PDA培养基上培养5-7天筛选转化子。AGL-1菌株转化后得到的转化子较多。这种优化体系对于用大丽轮枝菌XJ2008菌株构建插入突变体库及后续通过插入突变的方法筛选致病相关基因起到了重要作用。通过插入突变,共得到4890个T-DNA插入突变体。随机选取204个转化子,从拷贝数、菌落生长速度、产孢和致病性等方面进行分析。结果表明突变株是单拷贝插入并且可以稳定遗传。与野生型菌株相比,突变体可以明显的分为3种类型,34.7%的突变体的菌落生长速率显著下降,34.8%的突变体的菌落生长速率增加,16.8%的突变体丧失产生微菌核的能力,30.0%的突变体的分生孢子形成能力减弱。通过数据分析,各突变体在PDA培养基上的生长速率和病情指数之间存在高度的相关性(R2=0.9129),可以用于获得线性关系,并能合理解释菌落大小的变化和其致病症状之间的关系,而最大孢子数量和菌落大小变化百分比也存在显著相关性(R2=0.8936)。上述结果清楚地说明,突变体菌株的生长速率是其致病力的关键因素,尤其是当孢子形成速率比对照野生型菌株低的时候。用浸根法筛选致病性缺陷突变体,在所有的突变体中有27.1%的突变体存在致病性缺陷,其中VdAG30、VdAG153和VdAG151对感病品种冀棉11的致病性大幅下降。TAIL-PCR产物测序结果显示T-DNA区插入到一个在VdL17基因组中注释为G蛋白偶联受体的基因序列中,在基因组中命名为VDAG_04611.1。将T-DNA侧翼序列与大丽轮枝菌基因组BLAST比对后发现该基因大小为1386 bp,位于8号染色体,含有三个大小分别为55bp、57bp和117 bp的内含子。该项研究为克隆大丽轮枝菌致病相关基因和发育相关基因奠定了基础。
[Abstract]:In this paper , we used two kinds of Agrobacterium strains ( AGL1 and EHA105 ) to transform the growth rate and the growth rate of the mutant .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.44

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本文编号：1543924