球孢白僵菌MADS-box转录因子Bbrlm1与细胞壁完整性和毒力的关系

发布时间：2018-03-11 12:45

  本文选题：球孢白僵菌　切入点：细胞壁完整性　出处：《西南大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：球孢白僵菌是一种重要的昆虫病原真菌,目前已经被广泛应用于农、林和卫生害虫的防治,并逐渐成为研究寄主与昆虫互作的一个模式菌株。作为一种生防微生物,昆虫病原真菌在应用过程中易受田间干旱、紫外辐射和高温等不利因素以及宿主昆虫免疫反应的影响,限制了生防真菌的防效稳定性和应用范围。因此,研究昆虫病原真菌逆境胁迫反应及其与昆虫互作的机制,具有理论与实践的双重意义。细胞壁作为真菌细胞的一道重要屏障,在真菌的生长、形态发生以及适应环境等过程中均发挥着非常关键的作用,是研究昆虫病原真菌逆境胁迫反应及与昆虫互作的一个重要靶标。细胞壁完整性(CWI)途径又被称为slt2/mpkl/pkc1途径,不仅调节细胞壁结构、组成和功能,而且介导真菌的生长、发育以及逆境胁迫反应等。MADS-box转录因子Rlml是CWI途径调控的转录因子之一,在酵母以及少数丝状真菌中的功能已明确,但在不同的真菌中存在功能上的分化。CWI途径MAPK Bbslt2是介导球孢白僵菌细胞壁结构完整性的重要环节,但其潜在靶标转录因子Rlml的功能,尚不明确。本论文克隆了球孢白僵菌Rlml同源蛋白的编码基因Bbrlm1。通过基因敲除、回复互补和超量表达等手段研究了该基因与球孢白僵菌生长、发育、细胞壁完整性及侵染致病等生物学过程的关系。获得如下主要结果：1. Bbrlm1基因的克隆通过搜索球孢白僵菌基因组序列获得与酿酒酵母、构巢曲霉和烟曲霉等多种真菌Rlm1同源蛋白的编码基因Bbrlm1。序列分析发现,Bbrlm1含有1965 bp的开放阅读框,推测编码蛋白含有654个氨基酸,分子量约为70.08 kDa,pI为9.27,在N端第2-70 aa处含有一个保守的MADS-MEF2结构域,在第365-516 aa间含有功能未知的DUF3827结构域。系统进化树分析发现,Bbrlm1与蛹虫草的rlmA聚为一类。2. Bbrlm1的功能研究Bbrlm1参与调节球孢白僵菌生长。为揭示Bbrlm1介导的生物学过程,利用同源重组及超量表达等策略获得了相应的突变体。培养特性分析发现,Bbrlm1介导球孢白僵菌生长。在基础培养基(CZM)上,破坏Bbrlm1显著降低了菌落的生长速率,而超量表达则加快了菌落的生长速率。在完全培养基(1/4 SDY)上,基因破坏(ΔBbrlm1)和超量表达(OE-Bbrlml)菌株的菌落生长均滞后于野生菌株。在1/4 SDY培养基上,ΔBbrlml气生菌丝厚度明显变薄,而OE-Bbrlml的气生菌丝生长茂盛。可见,Bbrlm1影响球孢白僵菌生长,且与营养成分相关。Bbrlml介导球孢白僵菌产孢。在基础培养基上,破坏Bbrlm1显著提高了菌株的分生孢子产量,而超量表达则降低了产孢量；在完全培养基上,ABbrlml和OE-Bbrlml产孢量与野生型无明显差异。在完全培养条件下,基因破坏和超量表达均导致菌株芽生孢子产量显著下降。由此表明,Bbrlm1参与调节球孢白僵菌分生孢子和芽生孢子产生等过程。Bbrlml介导球孢白僵菌的细胞壁完整性。敲除或超量表达Bbrlml影响菌株对细胞壁合成胁迫剂和高温的敏感性,且因培养基不同而发生变化。在基础培养基上,ΔBbrlm1对荧光增白剂(CFW)的耐受性增强,而对SDS和高温的敏感性增强,对刚果红(CR)的敏感性则无明显影响。超量表达Bbrlm1则导致菌株对细胞壁合成抑制剂CFW和CR耐受性增强,对SDS和高温的敏感性则无明显影响。在完全培养基上,ΔBbrlm1对CFW和SDS的敏感性增强,而对CR耐受性增强,对高温的敏感性无明显影响。OE-Bbrlm1则对CFW、CR、SDS和高温的耐受性均增强。透射电镜观察发现,ΔBbrlml分生孢子细胞壁明显变形,而芽生孢子细胞壁结构与野生菌株无明显差异。OE-Bbrlm1的分生孢子细胞壁不仅变形,而且变薄。OE-Bbrlml芽生孢子细胞形态正常,但细胞壁厚度也明显变薄。由此表明,Bbrlm1依赖于营养的变化介导球孢白僵菌细胞壁结构完整性。Bbrlml介导球孢白僵菌的高渗敏感性。在基础培养基上,ABbrlm1对高渗(山梨醇和NaCl)的敏感性增强,而OE-Bbrlml菌株的高渗敏感性无明显变化。在完全培养基上,破坏和超量表达Bbrlm1均增强了菌株对高渗的耐受性。由此表明,Bbrlm1介导菌株对高渗胁迫的敏感性,且应营养条件不同而发生变化。Bbrlml介导球孢白僵菌的毒力。生物测定结果表明,将分生孢子接种于大蜡螟幼虫体壁时,ΔBbrlm1和OE-Bbrlm1毒力分别下降11%和7%；而通过注射接种分生孢子于昆虫血腔时,ΔBbrlm1和OE-Bbrlm1的毒力也分别下降9%和13%。由此可见,Bbrlm1严格调节球孢白僵菌毒力,破坏和超量表达Bbrlm1均导致菌株毒力下降。Bbrlml参与调节球孢白僵菌的次级代谢。Bbrlm1依赖于pH值介导一种橙色色素的产生。ABbrlm1在酸性条件下橙色色素的合成增加,而在碱性条件下减少。可见,Bbrlm1参与球孢白僵菌次级代谢的调节。Bbrlml影响球孢白僵菌产酸。ABbrlml在液体培养条件下产酸大量增加,pH下降明显。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.12

【共引文献】

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本文编号：1598229