长穗偃麦草和大米草全长cDNA文库的构建与耐逆基因筛选

发布时间：2018-03-24 22:39

本文选题：长穗偃麦草　切入点：大米草　出处：《南京农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：玉米是第一大粮食作物,能在不同的土壤条件和气候条件下种植。我国0.67亿公顷耕地中盐渍化土壤约占10%,但是玉米的耐盐能力比较低,当盐度大于17 mmol·L~(-1)时,50%以上的植物生长受到抑制。盐胁迫会引起玉米产量的降低。因此,研究玉米对盐胁迫的响应及其耐盐机制,对于玉米耐盐性改良具有非常重要的意义。然而,作为淡土植物的玉米,其耐盐机制非常复杂,耐盐性状常表现为多基因控制的数量遗传性状。采用常规育种或分子育种手段提高玉米耐盐性收效甚微。通过外源基因渐渗或转基因途径,利用野生耐盐植物基因资源创制耐盐玉米种质是提高玉米耐盐性的关键。目前,已有通过转基因途径提高玉米耐盐性的报道。耐盐转基因植物培育的一般做法是根据人们对植物耐盐机制的认识,挑选少数被认为与耐盐相关的基因进行操作,需要花费多年时间才能获得转基因植株,并且经常出现转基因植株目标性状表现不明显,甚至与预期结果不一致的现象。这种做法的缺点是周期长、效率低,不能突破现有知识的框架。为了快速、高效筛选、应用野生植物中的耐盐基因资源,本试验选择耐盐性较强的淡土植物—长穗偃麦草(Lophopyrum elongatumL.)和耐盐性超强的盐生C4植物—大米草(Spartin anglica Hubb)为材料,提取了不同浓度的NaCl和PEG-6000、不同处理时间下的幼苗RNA并等量混合。采用改良的SMART技术合成双链cDNA后,用Gateway方法将cDNA文库重组到植物转基因双元载体pMDC83,并将长穗偃麦草和大米草cDNA文库分别导入玉米或烟草BY-2细胞中,初步建立了快速筛选并挖掘植物耐盐基因的技术平台。主要结果如下:分别以 100、200、300、400 mmol L~(-1) 的 NaCl 和 20%、30%、50%(w/v)的 PEG-6000处理长穗偃麦草幼苗1 d、3d、5 d、7d,用5%(w/v)NaCl处理大米草幼苗1 d、3 d、5 d、7 d,分别提取RNA后等量混合为总RNA。采用改良的SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)方法合成全长 cDNA 后,用 Gateway 技术中的BP反应构建了长穗偃麦草和大米草全长入门cDNA文库,滴度分别为4.0× 1 06 cfu·mL~(-1)和4.3×106 cfu·mL~(-1),重组率均达98%以上。再采用LR反应,分别将两个入门文库重组到植物转基因双元载体pMDC83中,获得目标文库。长穗偃麦草和大米草的目标文库原始滴度为6.O×106 cfu·mL~(-1)和5.7×106 cfu·mL~(-1),插入片段平均长度均为0.45 kb,重组率均达100%。从两个目标文库中各随机挑取5个阳性克隆进行测序,并将测序结果在NCBI上进行BLASTX比对,发现其中3个长穗偃麦草阳性克隆的插入片段分别与植物bZIP转录因子、细胞壁水解酶、衰老相关蛋白等有较高程度的相似性,但是其余7个序列未比对到相似序列。采用本实验室建立的农杆菌侵染萌发花粉再授粉的方法,将长穗偃麦草和大米草cDNA目标文库导入玉米,获得了转基因玉米T0代种子。通过对T0代玉米种子的GFP荧光信号的观察、潮霉素抗性检测和PCR验证,证明外源基因成功导入玉米。用农杆菌侵染法将农杆菌与烟草BY-2细胞共培养,将长穗偃麦草目标文库转入烟草BY-2细胞中,在培养基中加入25mg·L~(-1)潮霉素和浓度分别为50mmol·L~(-1)、100 mmol·L~(-1) 和 200 mmol·L~(-1) 的 NaCl 对其进行筛选,在 50 mmol-L~(-1)、100 mmol·L~(-1) 的盐浓度下初步获得耐盐细胞系169个,而200 mmol·L~(-1) NaCl的盐浓度下没有发现耐盐转基因细胞系。本文为大规模快速筛选鉴定植株水平和细胞水平上的抗盐基因奠定了基础。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S188

【参考文献】