解淀粉芽孢杆菌NJN-6拮抗物质的分离鉴定及对土壤微生物区系的影响研究

发布时间：2018-04-23 18:24

本文选题：解淀粉芽孢杆菌 + 拮抗物质　；参考：《南京农业大学》2016年博士论文

【摘要】：土传枯萎病是由土传病原菌引起的毁灭性作物病害,严重制约着经济作物的生产。近年来,生物措施在土传病害的防控方面发挥着越来越重要的作用。本实验室从香蕉园发病区的健康植株根际分离得到了一株解淀粉芽孢杆菌NJN-6 (以下均简写为NJN-6),该菌株在实验室条件下能强烈抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌和番茄青枯病茄科劳尔氏菌的生长,并且在盆栽和大田试验中均表现出显著的促生和生防效果,但是其作用机理尚不清楚。本研究以NJN-6为供试菌株,分离鉴定其拮抗尖孢镰刀菌和茄科劳尔氏菌的活性物质,研究该菌株在香蕉的根际定殖能力以及利用香蕉根系分泌物生产拮抗物质的能力,然后采用高通量测序和定量PCR技术研究外源添加拮抗物质对土壤微生物区系的影响。得到了如下主要结果:1.利用正丁醇从NJN-6的发酵液中萃取得到iturin A类拮抗物质,通过高效液相色谱(HPLC)结合标准物质的保留时间定性鉴定出三种iturinA物质的存在。然后,利用HPLC/ESI-MS证明这三种物质的分子量分别为1043、1057和1071 Da,与三种iturin A标准品的分子量一致。利用大孔吸附树脂XAD-16,从NJN-6的发酵液中富集有效活性物质,通过HPLC结合自动馏分收集器分离得到五种活性物质。其中两种物质具有拮抗香蕉病原菌的作用,且被证明是分子量分别为1030 Da (C14)和1044 Da (C15)的bacillomycinD。另外三种物质能够拮抗番茄青枯病病原菌,且被证明分子量是分别为402、487 和 502 Da 的 macrolactin A、7-O-malonyl macrolactin A 和 7-O-succinyl macrolactinA。分离鉴定出的八种拮抗物质中,五种能够抑制真菌的生长,三种能抑制细菌的生长。2.构建了一种环保、快速、便捷的双水相体系:乙醇-硫酸铵系统。利用该系统从NJN-6菌株的发酵液中萃取得到iturin A,随后用HPLC对iturin A进行了定量分析。通过优化萃取体系的pH得到了 95%以上的萃取回收率,通过优化HPLC分析的柱温得到了较好的分离效果。该检测方法中iturin A出峰时间和峰面积的相对标准偏差分别在1.29%和1.45%。整个萃取和检测过程用时短、操作便捷,是一种快速定量发酵液中活性物质的定量方法。3.菌株NJN-6不仅能够分泌水溶性的拮抗物质,以便抑制病原菌的生长,而且还能在较远距离对尖孢镰刀菌产生抑制作用(超出水溶性物质的有效扩散范围),甚至在有物理阻隔完全切断水溶性物质交流的情况下(分隔平板中)仍表现出较强的抑制作用,表明NJN-6能够分泌挥发性的抑菌物质。在分隔平板实验中,NJN-6产生的挥发性物质能够抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长和孢子的萌发,其抑制效率达到了 35%。甚至能够显著地降低土壤中尖孢镰刀菌的孢子浓度,处理35天后,与对照相比,土壤中尖孢镰刀菌孢子的浓度降低了 1个数量级。利用固相微萃取对NJN-6产生的挥发性有机物进行有效富集,然后利用气相色谱-质谱(GC-MS )对挥发性物质进行鉴定。鉴定出的36种小分子的挥发性物质包含12种芳香类、7种烷烃类、3种醇类、7种酮类、2种烯烃类、3种萘酚类、1种酯类和1种醚类。通过纯品验证结果显示,有11种物质能够完全抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长;另外7种物质显示出了较好的抑制效果(抑制率80%);其余18种物质的抑制效果在6.12%和78.8%之间。鉴定出的这些物质及其良好的对尖孢镰刀菌的抑制效果表明了挥发性物质的分泌在NJN-6菌株拮抗尖孢镰刀菌过程中起重要作用。4.通过纯培养条件下,利用扫描电镜对NJN-6的生物膜形成和根际定殖能力进行测试,表明NJN-6具有在香蕉根际良好的定殖能力。采用根系分泌物作为基础培养基对NJN-6振荡培养后,对其发酵液进行液质联用检测,发现NJN-6能利用根系分泌物产生脂肽类拮抗物质和植物类激素促生物质;同时,该菌株在根系分泌物存在的条件下,其产拮抗物质基因和生物膜形成基因均上调表达。综合两方面的结果表明,NJN-6菌株能够在根际定殖,并且利用根系分泌物生存繁殖并且产生活性物质。5. Macrolactin是一类抗菌效果极佳的细菌生长抑制剂。然而,其对土壤中细菌群落结构以及土壤中本身产macrolactin基因丰度的影响尚不清楚,本实验通过外源添加从NJN-6发酵液中分离出的macrolactin类物质到土壤后,研究其对土壤细菌群落的影响。经过四周的处理,表明macrolactin类物质能显著地降低细菌群落的生态多样性和大多数类群的相对丰度。但变形菌门,尤其是伯克氏菌属、Dyella属和Rhodanobacter属的相对丰度和绝对丰度不但没有减少,反正有不同程度的增加。文献报道,这三个属的菌均有降解农业化学品的作用。同时,macrolactin类物质的添加致使土壤本身产macrolactin类物质的polyketide synthase (PKS )基因丰度显著下降。6.脂肽作为一大类抗真菌物质,具有显著抑制真菌菌丝生长和孢子萌发的作用。同样,其对土壤真菌群落以及土壤中产脂肽基因丰度的影响并无相关报道。本文通过外源添加从NJN-6发酵液中分离获得的脂肽类物质到土壤后,研究其对土壤真菌群落的影响。结果表明微生物源的抗真菌物质-脂肽类物质的施入能显著地降低真菌的丰度和真菌群落的多样性,而木质素降解相关真菌类群(毛孢子菌属和隐球菌属)的相对丰度在外源添加脂肽物质后显著增加。同时,土壤自身中产拮抗物质的Non-ribosomal peptides synthase (NRPS)基因丰度随着脂肽类物质的加入而显著降低。证明微生物源的抗真菌物质和化学合成的农业杀真菌剂一样能够改变土壤真菌的群落结构,广谱性的杀灭有益菌和病原菌。而土壤本土拮抗物质的基因丰度也因为外源拮抗物质的加入而发生显著的变化。这些结果将对后续微生物源拮抗物质的大田使用提供相关参考。7.采用分隔平板(一边培养菌株,一边放置土壤)培养NJN-6实时产生得到挥发性有机物质,以此衡量其对土壤微生物的群落结构和组成以及部分功能基因产生的影响。结果表明挥发性有机物对土壤总细菌丰度具有增加作用,而对土壤总真菌丰度具有降低作用。高通量测序表明挥发性有机物显著地降低了土壤细菌和真菌群落结构的alpha多样性。另外,挥发性物质还对土壤微生物产生的两种主要拮抗物质的相关基因-PKS和NRPS产生显著地抑制作用,同时降低了参与氮循环过程中的AOA、nifH和nirS的基因丰度,增加了 AOB的基因丰度。结论:解淀粉芽孢杆菌NJN-6能够产生大量拮抗土传枯萎病原菌和拮抗番茄青枯病病原菌的物质,是一株防控土传病害的良好生防菌;能够利用根系分泌物在根际定殖和分泌活性物质,而这些具有抗菌作用的微生物源拮抗物质会显著影响土壤微生物群落组成,说明通过施用生防菌,能够显著影响土壤微生物区系,实现调控土壤微生物区系的目的。
[Abstract]:Five kinds of antagonistic substances were isolated and identified by HPLC / ESI - MS . Five kinds of active substances were isolated and identified by HPLC / ESI - MS . The results showed that 11 species contained 12 aromatic , 7 alkanes , 3 alcohols , 7 ketones , 2 olefins , 3 naphthol , 1 esters and 1 ether . In this paper , it is not clear that the relative abundance and the absolute abundance of the antagonistic substances in the soil can significantly decrease the ecological diversity of the fungi and the relative abundance of most species .

【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S154.3;S476.1

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