【摘要】：棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)作为核型多角体病毒Group II中的代表物种,其基因组序列已在2001年被报道。相比模式物种苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Auca MNPV)的功能基因组学研究,HearNPV的ORFs仅有不到50%的被研究报道,而80%以上的AucaMNPV ORFs已经得到了较好的诠释。本文针对ha83和ha86两个HearNPV的基因展开了研究。其中ha83在AucaMNPV中并无同源基因的报道,作为一个能编码几丁质结合功能域(chitin binding dimain,CBD)的基因,本文对该基因的功能及其所编码的CBD的功能进行了较深入的探讨;ha86与AucaMNPV中的ac98为同源基因,编码杆状病毒的38K蛋白,是杆状病毒的核心基因之一,本文针对其同源性,对ha86与其基因同源基因的功能进行了比较研究。取得的主要研究结果如下:I.Ha83的功能研究结果1.利用5’和3’RACE对ha83的转录本进行分析,结果表明ha83的转录起始位点位于其起始密码子(ATG)上游的374 nt处,且这段5’非翻译区包含有复杂的转录调控元件——共包括两个TATA box(分别位于-107和-293 nt处)、两个晚期强启动元件ATAAG(-202 nt处)和TAAG(-27 nt处)以及五个早期启动元件CATT(分别位于-67、-187、-211、-255和-310 nt处),这预示着ha83的转录或许受到多因素的调控;ha83的多聚腺苷酸化终止信号序列(AATAAA)与终止密码(TAA)相重叠,3’端的转录终止于其终止密码子的下游16 nt处,具有典型的PolyA尾巴。2.针对Ha83中的已报道的CBD中所包含的6个保守的半胱氨酸(Cys),进行截短体研究。通过I-TASSER系统对Ha83及其CBD中保守Cys的截短体蛋白(TC151,TC142,TC128,TC118,TC113,TC71)结构进行预测。结果发现11、15、19号氨基酸残基可能为Ha83及其CBD截短体的蛋白的配体结合位点。3.利用PCR技术针对Ha83及其CBD编码区的6个保守Cys构建了6个截短体的原核表达载体。通过原核表达和纯化,对Ha83及其CBD截短体蛋白进行几丁质结合能力的检测,结果表明被测蛋白与几丁质的结合能力会随着Ha83蛋白CBD中的保守半胱氨酸的缺失而下降,其中缺失所有保守Cys的突变体蛋白TC71的Kd为7.6μM,而Ha83的Kd为0.62μM,即Ha83与几丁质的结合能力比TC71高出13倍以上。4.针对Ha83的CBD中的保守Cys,构建了对Ha83及其CBD截短体蛋白的真核表达载体,旨在研究cbd与蛋白的亚细胞定位的关系。结果表明,ha83会在转染后72小时全部转移到细胞核中,而缺失了cys128、cys118、cys113、以及cys71的ha83突变体蛋白,在转染后72小时失去了蛋白亚细胞定位的极性,即tc128,tc118,tc113,tc71并未全部被转移至细胞核中,而是均匀的分布于整个细胞中。5.构建了ha83缺失/修复系统,通过对ha83的缺失体、恢复体以及野生型病毒在转染hzam1细胞后的比较,发现ha83的缺失会导致bv病毒产量的降低但病毒dna的复制量却会升高;ha83缺失型hearnpv在细胞水平上的感染能力相较恢复型病毒和野生型病毒有所下降。6.在透射电镜以及扫描电镜的观察下,发现ha83的缺失会导致病毒多角体粒子的形状发生改变,且缺失体病毒的多角体的直径会比野生型病毒的多角体的直径大25%左右。此外ha83的缺失还会导致单个多角体中所包含的odv病毒数量显著减少,相较野生型病毒而言,ha83缺失型病毒的单个多角体odv含量减少了上百倍。7.为了进一步明确ha83与多角体的形成和odv的包埋之间的关系,对ha83缺失型以及野生型病毒转染后的hzam1细胞中的病毒多角体结构相关基因以及odv结构相关基因进行了转录水平的检测。结果表明,ha83的缺失会导致polyhedrin和p10这两个多角体结构相关的基因转录水平的下调,同时也会导致ha90、ha66、cg30、ha9、38k、p24、pif2、odv-e66、ha100、helicase、ie-1、lef-3、odv-e43、odv-e56这些odv结构相关的基因转录水平的下调,但却会意外的导致另外两个odv结构相关的基因ha40和gp41在转录水平的上调。iiha86的功能研究结果1.利用5’和3’race对ha86的转录本进行分析,结果表明ha86的转录起始位点位于其起始密码子(atg)的上游208nt处。其5’非翻译区含有1个晚期强启动元件ataag(位于-136nt处)和2个早期启动元件catt(分别位于-94和-197nt处);ha86无典型的多聚腺苷酸化终止信号序列;ha863’端的转录终止于终止密码子的下游54nt处,具有典型的polya尾巴。2.利用反转录pcr以及westernblot技术,对ha86的转录时相和表达时相进行了检测。结果表明ha86在hearnpv感染hzam1细胞12小时后开始转录,并持续到感染后96小时;ha86在感染后24小时开始表达并持续到感染后96小时,是一个典型的晚期表达基因。3.通过blast分析,在ha86的135-202aa区间以及蛋白ac98(aucamnpv中与ha86同源的蛋白)的136-203aa区间均预测到了保守的类似卤酸脱卤酶水解酶结构域(haloaciddehalogenase-likehydrolasesdomain,had)。通过同源性分析,这一had结构域在杆状病毒38k蛋白中保守性更高于38k蛋白之间的保守性,且had功能域中的第5、6、7、42、43号氨基酸极有可能是had与配体结合的位点。4.构建了ha86缺失/修复系统,通过对ha86的缺失型、恢复型以及野生型病毒在转染HzAM1细胞后的比较,发现ha86的缺失会导致病毒无法产生具有感染能力的出芽病毒,但并不影响病毒DNA的复制;ha86缺失型病毒能产生形态正常的核衣壳病毒粒子,但无法形成含有ODV的包涵体病毒粒子,表明ha86可能与ODV的形成或是ODV的包埋有关。5.为了进一步确认ha86与ac98功能的异同以及HAD序列的重要性,借助Bac-to-Bac系统将HearNPV来源或AucaMNPV来源的38k以及HAD异源修复到ha86缺失型病毒中。结果发现ha86的缺失对病毒所造成的影响无法被其同源基因ac98或是HAD序列所补救,当ha86缺失型病毒恢复了ac98、haHAD或是acHAD后,依旧无法产生具有感染能力的出芽型病毒粒子。6.构建了一系列HearNPV来源或AucaMNPV来源的38k以及HAD融合HA-tag的真核表达HearNPV bacmid,将这些bacmid转染Hz AM1细胞进行免疫共聚焦观察。结果发现Ha86在转染后18小时开始在细胞质中表达,在转染后24小时后均匀分布于整个细胞中;在转染后60小时,Ha86在细胞内大量堆积,大部分Ha86分布在细胞核中;在转染后72小时,仅细胞核中检测到Ha86的分布。Ha86在HzAM1细胞中的定位与已报道的同源蛋白Ac98在sf9细胞中的亚细胞定位完全相符,但Ac98、HaHAD以及AcHAD在HzAM1细胞中的亚细胞定位却没有类似Ha86的特异性,三者都均匀分布于细胞核和细胞质中。7.通过对比Ha86多克隆抗体以及HA-tag标签抗体杂交的Western blot结果,发现Ha86与Ac98,或HaHAD与AcHAD的抗原性差异较大,说明两种来源的蛋白在结构上差异较大,这也是二者之间无法代替的原因之一。综上所述,两个基因的功能基本明确,其中ha83对HearNPV在宿主细胞中的生长以及组装均有较大影响,其编码的CBD与Ha83的亚细胞定位也存在关联;ha86虽然在很多方面都与已报道的同源基因ac98相似,但ha86不仅对HearNPV产生具有感染能力的出芽病毒是必需的,且该基因的功能是HAD编码区或其它同源基因无法替代的。以上研究结论为深入理解HearNPV的功能基因组学奠定了基础。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.13
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本文编号：
2327025
